六味补气方对COPD大鼠肺部衰老相关分泌表型及NF-кB/SIRT-1/p53信号通路的影响

谢桂元,刘向国,方 芳,于芳春,吴柏合,赵晶燕,方 远

(安徽中医药大学,安徽 合肥 230000)

慢性阻塞性肺疾病(COPD)是一种常见的呼吸系统疾病,常被认为由肺衰老加速和炎症反应引起,目前已成为全球第三大死亡因素。COPD的肺部衰老主要有氧化应激、细胞衰老与炎性衰老、端粒功能障碍和抗衰老分子等参与[1],其中炎性衰老可激活核因子κB (NF-κB)信号通路,引起肿瘤坏死因-α(TNF-α)、白细胞介素- 6(IL-6)等相关炎性因子的表达,促进肺部炎症和肺部衰老[2]。衰老相关分泌表型(SASP)最早由Coppé等[3]提出,可分泌一系列炎性细胞因子(TNF-α、IL-6等)、生长因子、蛋白酶等,可刺激炎性反应的发生,促使衰老。p53蛋白是衰老常见指标,其不仅可以通过下调TNF-α对机体衰老起调控作用,还可以通过抑制炎症反应延缓COPD的发展进程。沉默信息调节因子相关酶1(SIRT-1) 是一种组蛋白去乙酰化酶,可以反向调控NF-κB信号通路炎性反应的发生,再由NF-κB信号通路调控p53蛋白,其也可直接作用于p53蛋白,减少DNA损伤,抑制细胞衰老和炎症反应,延缓SASP进程,从而调控COPD肺部衰老的发生发展进程[4-5]。六味补气方是安徽中医药大学第一附属医院治疗COPD的经验方,本课题组前期研究证实该方可通过调节干扰素-γ(IFN-γ)、TLR4等增强免疫功能,减轻炎症反应,延缓COPD的发展进程[6-7]。但六味补气方对于 COPD肺部衰老和SASP的影响机制研究尚不明确,故本研究基于SIRT-1/NF-кB/p53信号通路探讨了六味补气方对COPD大鼠肺部SASP的作用。

1 实验材料和方法

1.1实验动物 SPF级大鼠60只,体重190～210 g,购自济南朋悦实验动物繁殖有限公司,生产许可证号:SCXK(鲁)20190003。所有大鼠饲养于安徽中医药大学新安医学重点实验室动物室,室温19～24 ℃,湿度48%～62%。本实验已通过安徽中医药大学实验动物伦理委员会审核(动物伦理编号:AHUCM-rats-2021069)。

1.2药物 六味补气方组方:炙黄芪15 g、生晒参10 g、玉竹10 g、益智仁6 g、陈皮6 g、肉桂3 g(药材购自安徽中医药大学第一附属医院中药房),将上述药物加入300 mL水浸泡50 min,武火沸腾换文火煎药40 min,生晒参单独煎。将药汤倒至烧杯,置于水浴锅中加温浓缩,配置六味补气方低、中、高剂量浓度分别为0.27 g/kg、0.52 g/kg、1.05 g/kg,相当于临床等效量的3.1,6.2,12.4倍;桂龙咳喘宁片(桂龙药业安徽有限公司,国药准字Z20053135,规格:0.3 g/片)。

1.3主要试剂及仪器 脂多糖(LPS ,Solarbio生物科技公司, L8880);红塔山香烟(焦油含量13 mg, 烟碱含量1.1 mg),滁州烟卷厂。IL-6 ELISA检测试剂盒(武汉基因美科技有限公司,JYM0646Ra);TNF-α ELISA检测试剂盒(武汉基因美科技有限公司,JYM0635Ra);NF-κB抗体(abcam,GR3422076-1);抗兔两步法检测试剂盒(ebiogo,11162110);SIRT-1(Bioworld,AAD33161);p53(bsm-33058M,AH06013022);山羊抗小鼠抗体(Zsbio,140193);山羊抗兔抗体(Zsbio,202700514); ECL超敏发光试剂盒(Thermo,VC298015)。自制烟熏箱(1 m3),动物肺功能检测仪(北京贝兰博公司,Ani Rws 2005),石蜡切片机(上海徕卡有限公司,RM2016),生物组织石蜡包埋机(湖北亚光,YB-7LF),光学显微镜(Nikon EcliPse CI),PAP Pen免疫组化笔(ebiogo,B007),自动曝光仪(上海培清科技有限公司,JS-1070P)。

1.4实验方法 将大鼠按随机数字表法分为正常组、模型组、桂龙咳喘宁组和六味补气低、中、高剂量组,每组10只。正常组无特殊处理,其余各组大鼠采用香烟烟雾联合气管滴注LPS的方法[7-8]进行COPD造模:于实验第1天和第14天采用3%巴比妥麻醉大鼠后,切开颈部暴露气管,从气管注入LPS 200 μL(1 mL/1 mg);非LPS滴注日,将大鼠放入自制烟熏箱中,18支香烟混合60 g锯齿末点燃,每日烟熏2次,每次25 min,共造模6周。根据大鼠的生理学特性、肺功能和肺组织病理变化判定造模是否成功。于造模第7周第1天开始,六味补气低、中、高剂量组分别灌胃0.27 g/kg、0.52 g/kg、1.05 g/kg的六味补气方混悬液,桂龙咳喘宁组灌胃0.8 mg/kg的桂龙咳喘宁片混悬液,正常组和模型组灌胃等体积生理盐水,均每日2次,连续6周。

1.5检测指标及方法

1.5.1大鼠一般情况 每日记录各组大鼠的一般情况与呼吸系统情况。

1.5.2肺功能 灌胃结束后第2天,采用3%的戊巴比妥钠(30 mg/kg)麻醉大鼠,手术暴露气管并进行插管,连接肺功能检测仪器进行检测,记录呼气峰流速(PEF)、第0.3秒用力呼气容积(FEV0.3)及FEV0.3与用力肺活量(FVC)比值(FEV0.3/FVC)。

1.5.3肺泡灌洗液中TNF-α、IL-6含量 待大鼠肺功能测定完毕后,暴露颈部气管,插入灌胃针并扎紧,注入生理盐水来回抽吸5次后获得肺泡灌洗液,将其注入试管中,3 000 r/min离心5 min,取上清液于EP管中-80 ℃保存,采用ELISA法测定TNF-α、IL-6含量。

1.5.4肺组织病理学形态 打开大鼠胸腔,取出肺组织,用4%多聚甲醛溶液进行固定,常规脱水、透明、浸蜡、包埋,连续5 μm厚切片, HE染色,光镜观察肺组织病理学形态并摄片。

1.5.5肺组织中NF-κB表达情况 采用免疫组化SP法检测:将组织学切片依次经过脱蜡水化、抗原修复、阻断内源性过氧化物酶、封闭、加入1∶2 000的兔抗NF-кB抗体、加入1∶2 000的兔抗二抗NF-κB抗体、DAB显色、苏木精复染、封片,光镜观察并摄片。细胞内出现棕黄色颗粒为NF-κB阳性表达。

1.5.6肺组织中SIRT-1和p53蛋白表达情况采用Western blot 法检测:将肺组织置于液氮中速冻,肺组织样本裂解后离心取上清液,进行电泳、转膜、封闭。分别加入1∶1 000的兔抗SIRT-1抗体、1∶1 000的鼠抗p53抗体和1∶2 000的鼠抗GAPDH抗体,孵育过夜洗膜后,加入1∶20 000 HPR标记的山羊抗兔二抗和山羊抗鼠二抗,室温孵育1.2 h,洗去二抗,使用ECL试剂盒检测蛋白表达情况,采用Image J分析胶状条带,计算蛋白相对表达量。

2 结 果

2.1各组大鼠一般情况 正常组大鼠精神状态良好,进食正常,反应灵敏,二便正常,体重正常增加,呼吸均匀无喘息、咳嗽等问题;模型组大鼠精神萎靡,食欲不振,体型瘦小,反应迟钝,呼吸困难伴有喘息甚至有张口呼吸,口鼻有分泌物,烟熏过程中会有出汗表现,部分有脱毛;与模型组比较,各药物组大鼠精神、食欲、体型、呼吸情况等均有不同程度改善,其中六味补气高剂量组改善效果与桂龙咳喘宁组相似。

2.2各组大鼠肺功能比较 模型组大鼠PEF、FEV0.3、FEV0.3/FVC均明显低于正常组(P均<0.05);各药物组大鼠PEF、FEV0.3、FEV0.3/FVC均明显高于模型组(P均<0.05),六味补气各组PEF、FEV0.3、FEV0.3/FVC均明显低于桂龙咳喘宁组(P均<0.05),其中六味补气高剂量组各指标与桂龙咳喘宁组差距最小。见表1。

表1 正常组和慢性阻塞性肺疾病各组大鼠肺功能指标比较

2.3各组大鼠肺组织病理学形态 正常组大鼠肺内细支气管黏膜存在皱襞且完整,管壁内上皮排列正常,腺体结构完整;肺泡大小正常,肺泡间隔完整。模型组大鼠细支气管黏膜结构不完整,管壁结构发生破坏且管腔变窄,管壁内纤毛排列不规整,存在倒伏,腺体增生肥大;肺泡壁变薄塌陷,肺泡腔发生融合,肺泡腔和肺间质内发生炎性浸润。与模型组比较,各药物组大鼠细支气管结构壁和黏膜相对完整,肺泡塌陷和肺泡腔融合有所改善,肺泡腔和肺间质炎性浸润减少,其中以六味补气高剂量组改善更为明显。见图1。

图1 正常组和慢性阻塞性肺疾病各组大鼠肺组织病理学形态(HE染色,×200)

2.4各组大鼠肺泡灌洗液中IL-6和TNF-α含量比较 模型组大鼠肺泡灌洗液中IL-6和TNF-α含量均明显高于正常组(P均<0.05);各药物组大鼠肺泡灌洗液中IL-6和TNF-α含量均明显低于模型组(P均<0.05),且六味补气各组IL-6和TNF-α含量均明显低于桂龙咳喘宁组(P均<0.05),其中六味补气高剂量组IL-6和TNF-α含量均明显低于六味补气低、中剂量组(P均<0.05)。见表2。

表2 正常组和慢性阻塞性肺疾病各组大鼠肺泡灌洗液中IL-6和TNF-α含量比较

2.5各组大鼠肺组织NF-κB蛋白阳性表达情况正常组大鼠肺组织中无NF-κB蛋白表达;模型组大鼠肺组织中NF-κB蛋白呈强阳性表达;各药物组大鼠肺组织中NF-κB蛋白阳性表达较模型组少,其中六味补气低、中剂量组及桂龙咳喘宁组呈中度表达,六味补气高剂量组呈低度表达。见图2。2.6各组大鼠肺组织SIRT-1和p53蛋白表达情况比较 与正常组比较,模型组大鼠肺组织中SIRT-1蛋白相对表达量明显降低(P<0.05),p53蛋白相对表达量明显升高(P<0.05)。与模型组比较,各药物组大鼠肺组织中SIRT-1蛋白相对表达量均不同程度升高(P均<0.05),p53蛋白相对表达量均不同程度降低(P均<0.05)。与桂龙咳喘宁组比较,六味补气低、中剂量组大鼠肺组织中SIRT-1蛋白相对表达量和六味补气中、高剂量组大鼠肺组织中p53蛋白相对表达量更低(P均<0.05),六味补气高剂量组大鼠肺组织中SIRT-1蛋白相对表达量和六味补气低剂量组大鼠肺组织中p53蛋白相对表达量更高(P均<0.05)。见图3。

图2 正常组和慢性阻塞性肺疾病各组大鼠肺组织中NF-κB蛋白阳性表达情况(免疫组化SP染色,×200)

图3 正常组和慢性阻塞性肺疾病各组大鼠肺组织中SIRT-1和p53蛋白表达情况

3 讨 论

肺部衰老与COPD的发展关系密切[9-10]。

COPD被认为是一种“加速衰老”的表型,但同时衰老也可能导致COPD的发生发展[11]。COPD可表现为慢性非特异性炎症,衰老是引起COPD肺部炎症的关键因素。COPD发生过程中,氧化应激反应可引起DNA的损伤,导致出现衰老相关表型特征,表现为NF-κB信号通路的激活,并出现SASP,其中包括IL-6、IL-8、TNF-α等促炎细胞因子,TNF-α增加可激活NF-κB信号通路上的IκBα对IL-6进行上调,NF-κB信号通路的激活又可以正向反馈对TNF-α进行上调[12],且可调控p53蛋白,引起细胞损伤和衰老。Kim等[13]研究表明,NF-κB信号通路可以调节以TNF-α为主的SASP的分泌,进而延缓老年COPD患者的衰微。Adnot等[14]研究发现,来源于肺的SASP可将衰老过程传播给附近的肺组织和细胞,引起持续性的炎性反应,使COPD症状持续存在。

SIRT-1是一种核蛋白,与人体衰老密切相关,通过参与去乙酰化组蛋白、转录因子和其他蛋白修饰参与氧化应激反应、炎性反应和细胞凋亡抵抗的调节,这些反应与COPD 的发展密切相关。在吸烟患者肺部上皮细胞发现SIRT-1的表达量下降[15-16],吸烟使肺泡巨噬细胞和支气管上皮细胞中SIRT-1的表达减少,SIRT-1活性降低,通过SIRT-1去乙酰化的过程NF-κB p50的活性升高,NF-κB被激活,炎性因子IL-6、TNF-α水平升高[17]。研究发现在细胞衰老过程中,SIRT-1被敲除会加快SASP的进程,SASP进程加快会让IL-6、TNF-α水平升高[18]。刘珊等[19]研究证明白藜芦醇通过SIRT-1/NF-κB信号通路抑制SASP进程,延缓衰老。p53是一种肿瘤抑制因子,具有许多不同的翻译后修饰包括乙酰化、磷酸化等,其中乙酰化可增强p53稳定性,在细胞衰老和凋亡方面发挥重要作用。研究发现SIRT-1可通过对p53去乙酰化抑制细胞衰老和凋亡,也可直接降低p53表达,促进米色脂肪合成而抑制衰老[20]。SIRT-1/NF-κB/p53信号通路一方面由SIRT-1参与抑制NF-κB p50去乙酰化的过程, NF-κB信号通路被抑制,下调p53蛋白,NF-κB信号通路上的亚基IκBα被抑制,下调 IL-6、TNF-α等炎性因子,另一方面SIRT-1直接去乙酰化p53蛋白,使p53蛋白下调,抑制衰老,减慢SASP进程,降低炎症反应而延缓衰老。

中医认为COPD发生的根本是肺脾肾气虚交杂,临床上通常通过补宗气、调脾肾来改善COPD的炎症反应和衰老影响[21]。六味补气方可益气固表、补脾益肺固肾。方中生晒参含人参多糖、人参皂苷,能调节机体免疫功能,降低IL-1、IL-6、IL-8水平,具有明显抗炎作用[22];黄芪中黄芪多糖可以通过调节NF-κB信号通路减轻炎症反应,还可以通过Akt等靶点的作用发挥抗衰老作用[23];肉桂可改善衰老小鼠肠道微生物菌群,具有抗衰老作用[24];益智仁能通过提高抗氧化酶活力和抗氧化基因表达水平,延缓衰老[25]。

本实验结果显示,COPD模型大鼠FEV0.3、FEV0.3/FVC、PEF均下降,肺泡灌洗液中IL-6、TNF-α含量升高,肺组织中SIRT-1蛋白表达减少,NF-κB和p53蛋白表达增加;用六味补气方干预后,大鼠肺功能有一定改善,肺泡灌洗液中IL-6、TNF-α含量降低,SIRT-1蛋白表达增加,NF-κB和p53蛋白表达被抑制。因此推测六味补气方通过对SIRT-1/NF-κB/p53信号通路的调控,抑制COPD模型大鼠肺部SASP的表达,从而减轻炎症性衰老,延缓COPD发展。

利益冲突:所有作者均声明不存在利益冲突。