高效液相色谱法测定天然胶乳橡胶避孕套中苯佐卡因的含量

魏嫣 梅享林 李玲 余诗琪 叶上诗 田荻 湖北省医疗器械质量监督检验研究院 （湖北 武汉 430075）

内容提要： 目的：建立高效液相色谱法测定天然胶乳橡胶避孕套中苯佐卡因含量的方法。方法：天然胶乳橡胶避孕套加入100mL流动相经过超声萃取后，以XBridge C18 5μm（4.6mm×250mm，5μm）色谱柱进行分离；采用流动相：甲醇：水：冰醋酸（80:20:0.5）；检测波长为283nm；流速：0.5mL/min；柱温：35°C。结果：苯佐卡因含量测定在进样浓度0.957～95.744μg/mL的范围内呈良好的线性关系，相关系数r=0.9999，低浓度回收率为99.58%，RSD=2.8%；高浓度回收率为101.2%，RSD=1.0%；在低浓度和高浓度的两个添加水平范围内准确率和重复性良好。结论：该方法快速简便，重复性好，结果准确可靠，可用于天然胶乳橡胶避孕套中苯佐卡因含量测定。

苯佐卡因是一种表面麻醉剂，化学名为对氨基苯甲酸乙酯，其作用强度较小，起效时间短，在使用30s后便能产生作用，同时苯佐卡因是一种脂溶性较强的药物，易与黏膜或皮肤的脂层结合，临床用于人的皮肤、黏膜和创面的镇痛，能阻断神经冲动传导，麻痹干净神经末梢而产生止痛、止痒效果[1]。目前应用在避孕套中用于延长男性在性生活中达到性高潮时间。如果加入的苯佐卡因浓度过高，会产生高铁血红蛋白症的不良反应，使用高含量苯佐卡因的天然胶乳橡胶避孕套也会产生刺激反应，同时国内外已有相关研究表明一些人群会对苯佐卡因产生过敏性炎症[2]。美国食品药品监督管理局网站也发布提醒，非处方药类牙龈或口腔止痛凝胶和溶液的主要成分苯佐卡因，可能与一种罕见但是严重的不良反应高铁血红蛋白症有关[3]。为了保证用械安全，必须对添加药物苯佐卡因含量进行严格控制，迫切需要建立一种标准检验方法对特殊使用的天然胶乳橡胶避孕套中的药物苯佐卡因含量进行监督和质量控制。

避孕套作为主要的避孕器具，因其使用方法简单、副作用小等特点，在世界各国得到广泛应用。避孕套的质量与人们的生殖健康密切相关。它通过非药物形式阻止受孕，并且可对防止艾滋病等性别传播发挥重要作用[4]。在国家食品药品监督管理局医疗器械分类目录中，含有苯佐卡因的避孕套被归于三类器械管理。随着人们对药品安全的关注及对用药安全的诉求日益增加，特别是医疗器械中药物残留和药物浓度监测已经成为社会关注的热点话题。天然胶乳橡胶避孕套中添加过量苯佐卡因的安全隐患也应该引起关注。

目前，国内针对苯佐卡因的研究检测多为对其药用制品中的含量测定[5]。现行国行标准中仅有SN/T 2802-2011《进出口动物源性食品中苯佐卡因残留量的测定 液相色谱法》和SN/T 5441-2022《出口水产品中三卡因、苯佐卡因、喹哪啶残留量的测定 液相色谱-质谱/质谱法》，在水产品及动物源性食品中的残留进行了控制和检测。专门针对医疗器械中含量测定检测研究较少。天然胶乳橡胶避孕套和水产品、动物源性食品的基质不同，前处理方法也不同。因此，本文从切实保障人民群众用械安全，有序规范特殊用途的天然胶乳橡胶避孕套行业的健康发展出发，建立使用高效液相色谱法测定苯佐卡因药物含量的方法，该方法快速简便，结果准确可靠。对比现有文献方法，将方法的线性范围缩小为1～100μg/mL，可以更好地满足微量含量测定的需求，进一步为制定天然胶乳橡胶避孕套中苯佐卡因含量测定标准提供可靠依据[6]。

1.材料与方法

1.1 一般材料

试验起止时间：2021年8月～2023年4月。

天然胶乳橡胶避孕套样品为市售标称含有苯佐卡因的天然胶乳橡胶避孕套和标称不含苯佐卡因的天然胶乳橡胶避孕套。

仪器设备：高效液相色谱仪（日本岛津，LC-20AD泵，SIL-20A进样器，SPD-M20A紫外检测器，CTO-20AC柱温箱）；十万分之一电子分析天平（METTLER TOLEDO，XP205）；超纯水器（Milli-Q，Reference）；超声波提取仪（厦门致微仪器有限公司，S04H）。

药品与试剂：苯佐卡因标准品（批号100454-201602，纯度99.9%，生产厂家：中国食品药品检定研究院）；甲醇（批号016954，色谱纯，生产厂家：MREDA）；冰醋酸（批号10000208，优级纯，生产厂家：中国国药集团化学试剂）。水为超纯水机生产的纯化水。

1.2 方法

1.2.1 色谱条件

色谱柱：XBridge C18 5μm（4.6mm×250mm，5μm）；流动相：甲醇：水：冰醋酸（80:20:0.5）；检测器：紫外检测器；检测波长：283nm；流速：0.5mL/min；柱温：35°C；进样量：20μL。

1.2.2 溶液配制

苯佐卡因标准储备液：精密称取苯佐卡因标准品0.05990g置50mL容量瓶中，加入一定量的流动相溶解，并使用流动相定容至刻度，摇匀，即得含有苯佐卡因浓度为1196.802μg/mL的标准储备液。

苯佐卡因标准溶液：精密移取苯佐卡因标准储备液适量于容量瓶中，用流动相稀释至刻度，配成标准溶液浓度范围为0.957～95.744μg/mL的系列标准溶液。

样品溶液配制：随机取天然胶乳橡胶避孕套样品1只，放入烧杯中，加入少量流动相溶液，超声振荡10min，使苯佐卡因能充分溶出，收集清洗液置于100mL容量瓶中。展开避孕套，正反两面加入流动相多次超声提取，合并清洗液于100mL容量瓶中。同时，用滴管吸取流动相溶液反复冲洗包装内侧，将清洗液合并到100mL容量瓶中，用流动相定容。0.45μm微孔滤膜过滤后作为供试品溶液。取标称未加苯佐卡因药物的空白天然胶乳橡胶避孕套1只，采用相同的样品处理方法制备空白套样品溶液。因每个批次的避孕套含量不同，在试验中对已经制备好的供试品溶液用流动相进行一定比例的稀释，作为样品溶液。

1.2.3 定量分析

1.2.3.1 标准曲线

取系列标准溶液，分别进样20μL，平行测定3次，以苯佐卡因的质量浓度为横坐标，苯佐卡因色谱峰的峰面积为纵坐标进行回归分析（n=6）。

1.2.3.2 专属性试验

分别取苯佐卡因标准溶液、标称未加入苯佐卡因的空白天然胶乳橡胶避孕套样品溶液、含苯佐卡因的天然胶乳橡胶避孕套样品溶液各20μL注入高效液相色谱仪，并记录色谱图。

1.2.3.3 系统适用性试验

取中间浓度点的标准溶液，连续进样6针，记录色谱图，测定苯佐卡因色谱峰的峰面积。

1.2.3.4 重复性试验

取同一个批次的样品6份，分别制备样品溶液，按照色谱条件进样测。重复性不仅考察方法的重复性，同时也与样品的均匀性有关，所以对于不同厂家不同批次的样品重复性指标存在一定的差异。

1.2.3.5 回收率试验

取已知浓度的样品溶液4mL，共12 份，分别设计23.936μg/mL和95.744μg/mL两种添加水平，每个水平设6个平行样品。按低、高浓度分别精密加入1mL已知浓度为23.936μg/mL 和95.744μg/mL 的对照品溶液，用流动相定容。按照色谱条件进行测试，计算回收率和相对标准偏差（Relative Standard Deviation，RSD）。

1.2.3.6 稳定性试验

随机取样品溶液1份，分别于0，2，12，24，48h注入高效液相色谱仪进行测定。

1.2.3.7 天然胶乳橡胶避孕套中苯佐卡因的含量测定

随机抽取不同企业的3只标称含有苯佐卡因的天然胶乳橡胶避孕套，分别按照上述方法制备样品溶液，滤过，取滤液20μL注入高效液相色谱仪。用外标法以峰面积进行计算，测定3批样品含量。

1.3 方法优化

1.3.1 波长选择

取苯佐卡因标准品适量，以流动相作为溶剂配制成含量约为5μg/mL的苯佐卡因溶液，微孔滤膜过滤后，用紫外分光光度计扫描，在283nm处有最大吸收，所以检测波长选择为283nm。

1.3.2 提取液体积的确定

为最大限度的节省有机溶剂使用量同时又能准确地对目标化合物进行很好地提取，保证药物完全从避孕套中洗脱，采用不同体积的流动相进行回收试验，因避孕套用润滑剂硅油也能被流动相溶解，提取溶剂体积太小会导致回收率低，样品不能实现充分清洗。提取溶剂体积太大会导致被测目标化合物浓度过低，低于线性范围的最低点不能准确定量。综合考虑提取效率和提取浓度选择清洗溶剂体积为100mL。

1.3.3 流动相优化

本实验首先比较研究甲醇：水、乙腈：水以及加入甲酸或者乙酸等作为流动相时，苯佐卡因色谱峰的相应信号和峰形，结果表明，以甲醇：水作为流动相时苯佐卡因色谱峰相应较高，加入0.5%冰醋酸后，峰形更好。同时又进一步比较研究了等度洗脱和梯度洗脱对苯佐卡因色谱峰峰形的影响，结果表明，等度洗脱基线更加稳定，也可以获得最优的色谱分离效果，峰形尖锐，对称性好。

2.结果

2.1 标准曲线

对系列标准溶液进行回归分析（n=6），得到回归方程（图1），回归方程为：y=237369x+105444，相关系数r=0.9999。结果表明，苯佐卡因浓度在0.957～95.744μg/mL范围内线性关系良好。

图1. 苯佐卡因含量测定标准曲线（n=6）

2.2 专属性试验

检测结果见图2。对照品溶液的保留时间为6.002min，理论踏板数为7133；标称未加入苯佐卡因的空白天然胶乳橡胶避孕套样品溶液在6.002min附近谱图为直线，未见苯佐卡因色谱峰；含苯佐卡因的天然胶乳橡胶避孕套样品溶液中苯佐卡因色谱峰保留时间为6.002min，理论踏板数为8274；说明保留时间为6.002min的色谱峰为苯佐卡因色谱峰，比对空白样品可知，经过前处理的样品，检测化合物出峰时间并无杂质峰干扰，基线平稳，峰形良好，标称未加入苯佐卡因的空白天然胶乳橡胶避孕套样品基质溶液在此条件下对苯佐卡因测定无干扰。

图2. HPLC 色谱图（注：2a.苯佐卡因对照品溶液；2b.空白天然胶乳橡胶避孕套样品溶液；2c.含苯佐卡因样品溶液）

2.3 系统适用性试验

中间浓度点的标准溶液连续进样6针，苯佐卡因色谱峰的峰面积分别为6106942、6001920、6001350、6002773、6013034、6004800。计算RSD为0.696%，理论踏板数为6760，拖尾因子为1.087。系统适用性良好。

2.4 重复性试验

同一个批次的样品6份样品溶液测得结果分别为26.45、25.59、26.51、26.16、25.88和25.85μg/mL，RSD为1.39%。表明该方法重复性良好。

2.5 回收率试验

已知浓度的样品溶液回收率和RSD，结果数据见表1。结果表明该方法准确性和重现性良好，符合准确度要求。

表1.回收率试验结果

2.6 稳定性试验

随机取样品溶液一份，分别于0，2，12，24，48h注入高效液相色谱仪进行测定，按苯佐卡因色谱峰的峰面积计算，RSD=1.28%。说明本方法至少在48h内测定，保证结果稳定。

2.7 天然胶乳橡胶避孕套中苯佐卡因的含量测定

随机抽取不同企业的3只标称含有苯佐卡因的天然胶乳橡胶避孕套，分别按照1.2.2方法制备样品溶液，滤过，取滤液20μL注入高效液相色谱仪。用外标法以峰面积进行计算，3批样品含量测定结果见表2，三批样品均有不同含量的苯佐卡因检出。

表2. 样品含量测定结果（μg /mL）

3.讨论

本文建立了用高效液相色谱法测定天然胶乳橡胶避孕套中苯佐卡因含量的方法，该方法专属性强，结果准确可靠，具有良好的线性、精密度和回收率，简单易行，可用于生产和检验中对特殊用途的天然胶乳橡胶避孕套进行质量控制。

天然胶乳橡胶避孕套中的苯佐卡因是附着并浸润在乳胶套上的。本方法采用超声、分次提取的方法，使苯佐卡因能最大限度提取。本文的样品制备方法将单包装的每个避孕套添加的药物均提取出来，此方法测得的药物含量并不是日常使用的实际接触量，而是生产企业的实际添加量。因苯佐卡因在醇类和乙腈等有机溶剂中可以溶解，在水中微溶。采用流动相进行提取既能保证提取效果，同时也可以保证峰形，通过计算回收率，采用流动相作为提取溶剂，可以将苯佐卡因完全洗脱下来。

已有文献对建立了避孕套中的苯佐卡因含量测定方法，此方法选用检测波长为265nm，线性范围为98.5～492.5μg/mL[6]。本方法的线性范围为0.957～95.744μg/mL，将最低定量浓度缩小了100倍，能实现对天然胶乳橡胶避孕套中低浓度样本的准确定量，满足微量检测苯佐卡因含量的需求。

目前，临床上广泛使用含有局部麻醉剂的避孕套来帮助男性延缓射精时间[7]。在使用这种表面涂有麻醉剂的避孕套时，部分麻醉剂可能通过女性阴道进入腹腔，并且可能造成慢性损害。这类产品如果不加以控制，不仅损害男性健康，还容易造成女性身体伤害。现阶段，避孕套中添加物研究在国内尚属空白，还未建立相关检测方法和安全限量标准。但避孕套属于使用量大的一种常用的医疗器械，其质量关系到千家万户的幸福。因此，对于天然胶乳橡胶避孕套中的添加药物对避孕套的性能和安全产生的影响应该受到重视。通过完善标准，有力监管，保障用械安全。