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反相高效液相色谱法测定刺五加叶中绿原酸和金丝桃苷含量

2023-11-05田国贺赵艳孙海涛韩松涛韩晓红逄焕欢

品牌与标准化 2023年6期
关键词:绿原酸

田国贺 赵艳 孙海涛 韩松涛 韩晓红 逄焕欢

【摘要】目的:建立HPLC法定量分析东北地区不同产地刺五加叶中绿原酸和金丝桃苷的含量。方法:采用三种不同品牌C18色谱柱,流动相A为0.3%磷酸溶液,流动相B为乙腈,梯度洗脱:0~3 min,95%A;3~10 min,95%~80%A;10~40 min,80%A;40~50 min,80%~10%A;流速1.0 mL/min;柱温35℃;进样量5μL;检测波长为354 nm。结果:绿原酸和金丝桃苷分别在0.39~5.9μg、0.08~1.2μg范围内呈良好的线性关系;精密度、稳定性、重复性试验RSD<1.1%,绿原酸和金丝桃苷的加样回收率分别为102.3%、98.4%。不同产地样品绿原酸含量范围为1.01 mg/g~10.71 mg/g;金丝桃苷含量范围为0.25 mg/g~1.49 mg/g。结论:建立的HPLC法可有效考察刺五加叶中多成分含量,不同地区间刺五加叶中绿原酸和金丝桃苷含量有差异。

【关键词】刺五加叶;绿原酸;金丝桃苷;反相高效液相色谱法

【DOI编码】10.3969/j.issn.1674-4977.2023.06.027

【基金项目】2023年吉林省中医药科技项目:中药材(中药饮片)刺五加叶质量评价的研究(2023075)。

Determination of Chlorogenic Acid and Hyperin in Acanthopanax Senticosus Leaves by Reversed Phase High-performance Liquid Chromatography

TIAN Guohe, ZHAO Yan, SUN Haitao, HAN Songtao, HAN Xiaohong, PANG Huanhuan*

(Jilin Provincial Institute for Drug Control and Research, Changchun 130000, China)

Abstract: Objective:To establish a HPLC method for quantitative analysis of chlorogenic acid and hyperoside in the leaves of acanthopanax senticosus from different areas in northeast of China. Method: Three different brands of C18 chromatographic columns were used, with mobile phase A being 0.3% phosphoric acid solution and mobile phase B being acetonitrile. Gradient elution: 0~3 minutes, 95% A; 3~10 minutes, 95%~80% A; 10~40 minutes, 80% A; 40~50 minutes, 80%~10% A; Flow rate 1.0 mL/min; Column temperature 35℃; Injection volume 5μL; Detection wavelength is 354 nm. Results: Chlorogenic acid and hyperoside showed a good linear relationship in the range of 0.39~5.9μg and 0.08~1.2μg; The RSD of precision, stability and repeatability test is less than 1.1%, and the recovery of chlorogenic acid and hyperoside are 102.3% and 98.4% respectively. The content of chlorogenic acid in samples from different areas ranges from 1.01 mg/g to 10.71 mg/g; The content range of hyperoside is 0.25 mg/g to 1.49 mg/g. Conclusion: The established HPLC method can effectively investigate the content of multi-component in the leaves of acanthopanax senticosus, and the content of chlorogenic acid and hyperoside is different in different regions.

Key words: acanthopanax senticosus leaves; chlorogenic acid; hyperoside; reversed phase high-performance liquid chromatography

刺五加是我國东北地区道地药材,东北三省的产量占全国总产量的90%以上[1]。各版《中华人民共和国药典》中刺五加药用部位为根、根茎及茎,同时近年文献也多集中在根及根茎的研究报道,刺五加作为药食同源的植物,史料中记载刺五加叶也可入药[2]。由于具有广泛的药用价值,导致野生刺五加资源遭受了严重的破坏,已被国家列为三级保护渐危品种。刺五加叶具有可再生性,但受药品标准规定限定,刺五加叶加工的产品多应用于保健品和功能性食品,因此有必要开展对刺五加叶活性成分的研究。

目前,我国对于刺五加的人工栽培主要集中在东北长白山,松花江等地区。刺五加叶主要成分为黄酮类、木脂素类、苯丙素类和多糖[3-4],本文通过对东北地区不同产地刺五加叶的质量研究考察中发现,其中绿原酸和金丝桃苷含量较高。为进一步了解不同产地的刺五加叶质量,本文建立HPLC法同时测定其中绿原酸及金丝桃苷含量。

岛津LC-20AT型高效液相色谱仪,SPD-M20A型DAD检测器;Mettler MS105型精密天平。

绿原酸对照品(中国食品药品检定研究院,批号110753-202119);金丝桃苷对照品(中国食品药品检定研究院,批号111521-202310)。乙腈为色谱纯(德国MERCK公司),水为屈臣氏蒸馏水,其他试剂均为分析纯。

刺五加叶来源于吉林省长白山十五道沟、靖宇县泉阳镇和辉南县小城子村、黑龙江省松江河老松江村和尚志市亚布力镇,共收集10批样品,经我院中药室专家鉴定为五加科植物刺五加的干燥叶。

2.1色谱条件

本试验考察了Sepax Amethyst C18-H(250×4.6 mm,5μm)柱;Waters SunFire C18 (4.6×250 mm,5μm)柱;Agilent Zorbax SB-C18 (250×4.6 mm,5 +m)柱,三种色谱柱在正文色谱条件下,测定同一供试品溶液(长白山十五道沟);流速:1.0 mL/min;检测波长:354 nm;柱温:35℃;流动相A:0.3%磷酸溶液,流动相B:乙腈,梯度程序如表1所示。

2.2系统适应性考察

在“2.1色谱条件”下,各色谱柱刺五加叶中绿原酸和金丝桃苷的理论塔板数分别为183170、134868、154879,绿原酸与相邻峰的分离度分别为13.263、14.459、15.297,金丝桃苷与相邻峰的分离度分别为1.501、1.623、1.609,且色谱图峰形对称。

2.3对照品溶液的制备

分别精密称取绿原酸和金丝桃苷对照品适量,加甲醇制成绿原酸和金丝桃苷的浓度分别约为0.4 mg/mL和0.08 mg/ mL的混合对照溶液,即得。

2.4供試品溶液的制备

取刺五加叶粗粉(过100目)1.0 g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入70%乙醇20 mL,称重,超声处理30 min,放冷,再称重,用75%乙醇补足减失的重量,摇匀,滤过,即得。

2.5线性关系考察

精密吸取对照品溶液1μL、2μL、5μL、8μL、10μL、15μL,分别注入液相色谱仪,记录峰面积。

以对照品溶液浓度(μg)为横坐标,峰面积为纵坐标绘制标准曲线,绿原酸标准曲线回归方程为:Y=928163X+76471,r=0.9990,进样量范围为0.39~5.9μg;金丝桃苷标准曲线回归方程为:Y=2131967X-1022,r=0.9999,进样量范围为0.08~1.2μg。

2.6稳定性试验

取刺五加叶(长白山十五道沟村)粗粉1.0 g,精密称定,按照“2.4”项下方法制备供试品溶液,室温下放置,分别于0、2、4、8、12、16、20、24 h进样5μL,依法测定绿原酸和金丝桃苷的峰面积值。结果绿原酸和金丝桃苷峰面积24小时内RSD分别为0.14%和0.22%,表明样品在制备供试品溶液后24 h内稳定。

2.7重复性试验

取刺五加叶(长白山十五道沟村)粗粉1.0 g,精密称取6份,每份约1.0 g,照“2.4”项下方法制备供试品溶液,依法进行测定。结果绿原酸含量为9.52 mg/g,RSD=1.05%;金丝桃苷含量为1.47 mg/g,RSD=1.1%,表明本测定方法的重复性良好。

2.8回收率试验

称取刺五加叶(长白山十五道沟村)粗粉0.5 g,精密称取6份,置具塞锥形瓶中,精密加入高中低浓度的各组分标准溶液,照“2.4”项下方法制备供试品溶液,依法进行测定,计算。结果绿原酸和金丝桃苷的平均加样回收率分别为102.3%和98.4%,RSD分别为0.5%和1.1%。

2.9实际样品测定

分别精密称取5个产地两批次的刺五加叶粗粉各约1.0 g,照“2.4”项下方法制备供试品溶液,具体数据见表2。不同产地样品绿原酸含量范围为1.01 mg/g~10.71 mg/g;金丝桃苷含量范围为0.25 mg/g~1.49 mg/g。吉林省长白山区域基地所产样品含绿原酸及金丝桃苷均较高。

3.1波长

本文采用二极管阵列检测器,其中紫外光谱图显示绿原酸在218 nm和327 nm波长处是最大吸收波长,金丝桃苷在255 nm和354 nm波长处是最大吸收波长。考虑绿原酸在354 nm波长处响应值仍较高,故选择354 nm波长处为测定波长。

3.2供试品制备方法

本文采用了75%乙醇、95%乙醇及75%甲醇和100%甲醇作为供试品提取溶剂,分别超声处理,结果以75%乙醇超声时绿原酸和金丝桃苷的样品含量最高,分别为9.54 mg/g和1.47 mg/g。

同时采用浸泡24小时后超声30分钟、超声30分钟、超声60分钟三种处理方式,结果绿原酸和金丝桃苷的样品含量基本无差距,确定处理方式为操作简便的超声处理30分钟。

【参考文献】

[1]张顺捷,李晓琳.刺五加资源的开发利用[J].中国食品药品监管,2021(5):108-111.

[2]徐春玲.刺五加叶活性成分研究及其产品开发[D].长春:吉林农业大学,2012.

[3]王晶瑶.刺五加和短梗五加叶及果镇静催眠活性对比研究[D].长春:吉林农业大学,2020.

[4]关欣,秦雯,谢百波,等.一测多评法测定刺五加叶中5个酚类成分含量的研究[J].北京城市学院学报,2021(1):69-73.

【作者简介】

田国贺,女,1982年出生,副主任药师,研究方向为药品检验与研究。

通讯作者:逄焕欢,女,1977年出生,副主任药师,研究方向为药品检验与研究,邮箱:1480325014@qq.com。

(编辑:侯睿琪)

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