反相高效液相色谱法测定刺五加叶中绿原酸和金丝桃苷含量

田国贺 赵艳 孙海涛 韩松涛 韩晓红 逄焕欢

【摘要】目的：建立HPLC法定量分析东北地区不同产地刺五加叶中绿原酸和金丝桃苷的含量。方法：采用三种不同品牌C18色谱柱，流动相A为0.3%磷酸溶液，流动相B为乙腈，梯度洗脱：0～3 min，95%A；3～10 min，95%～80%A；10～40 min，80%A；40～50 min，80%～10%A；流速1.0 mL/min；柱温35℃；进样量5μL；检测波长为354 nm。结果：绿原酸和金丝桃苷分别在0.39～5.9μg、0.08～1.2μg范围内呈良好的线性关系；精密度、稳定性、重复性试验RSD<1.1%，绿原酸和金丝桃苷的加样回收率分别为102.3%、98.4%。不同产地样品绿原酸含量范围为1.01 mg/g～10.71 mg/g；金丝桃苷含量范围为0.25 mg/g～1.49 mg/g。结论：建立的HPLC法可有效考察刺五加叶中多成分含量，不同地区间刺五加叶中绿原酸和金丝桃苷含量有差异。

【关键词】刺五加叶；绿原酸；金丝桃苷；反相高效液相色谱法

【DOI编码】10.3969/j.issn.1674-4977.2023.06.027

【基金项目】2023年吉林省中医药科技项目：中药材（中药饮片）刺五加叶质量评价的研究（2023075）。

Determination of Chlorogenic Acid and Hyperin in Acanthopanax Senticosus Leaves by Reversed Phase High-performance Liquid Chromatography

TIAN Guohe， ZHAO Yan， SUN Haitao， HAN Songtao， HAN Xiaohong， PANG Huanhuan*

（Jilin Provincial Institute for Drug Control and Research， Changchun 130000， China）

Abstract： Objective：To establish a HPLC method for quantitative analysis of chlorogenic acid and hyperoside in the leaves of acanthopanax senticosus from different areas in northeast of China. Method： Three different brands of C18 chromatographic columns were used， with mobile phase A being 0.3% phosphoric acid solution and mobile phase B being acetonitrile. Gradient elution： 0～3 minutes， 95% A； 3～10 minutes， 95%～80% A； 10～40 minutes， 80% A； 40～50 minutes， 80%～10% A； Flow rate 1.0 mL/min； Column temperature 35℃； Injection volume 5μL； Detection wavelength is 354 nm. Results： Chlorogenic acid and hyperoside showed a good linear relationship in the range of 0.39～5.9μg and 0.08～1.2μg； The RSD of precision， stability and repeatability test is less than 1.1%， and the recovery of chlorogenic acid and hyperoside are 102.3% and 98.4% respectively. The content of chlorogenic acid in samples from different areas ranges from 1.01 mg/g to 10.71 mg/g； The content range of hyperoside is 0.25 mg/g to 1.49 mg/g. Conclusion： The established HPLC method can effectively investigate the content of multi-component in the leaves of acanthopanax senticosus， and the content of chlorogenic acid and hyperoside is different in different regions.

Key words： acanthopanax senticosus leaves； chlorogenic acid； hyperoside； reversed phase high-performance liquid chromatography

刺五加是我國东北地区道地药材，东北三省的产量占全国总产量的90%以上[1]。各版《中华人民共和国药典》中刺五加药用部位为根、根茎及茎，同时近年文献也多集中在根及根茎的研究报道，刺五加作为药食同源的植物，史料中记载刺五加叶也可入药[2]。由于具有广泛的药用价值，导致野生刺五加资源遭受了严重的破坏，已被国家列为三级保护渐危品种。刺五加叶具有可再生性，但受药品标准规定限定，刺五加叶加工的产品多应用于保健品和功能性食品，因此有必要开展对刺五加叶活性成分的研究。

目前，我国对于刺五加的人工栽培主要集中在东北长白山，松花江等地区。刺五加叶主要成分为黄酮类、木脂素类、苯丙素类和多糖[3-4]，本文通过对东北地区不同产地刺五加叶的质量研究考察中发现，其中绿原酸和金丝桃苷含量较高。为进一步了解不同产地的刺五加叶质量，本文建立HPLC法同时测定其中绿原酸及金丝桃苷含量。

岛津LC-20AT型高效液相色谱仪，SPD-M20A型DAD检测器；Mettler MS105型精密天平。

绿原酸对照品（中国食品药品检定研究院，批号110753-202119）；金丝桃苷对照品（中国食品药品检定研究院，批号111521-202310）。乙腈为色谱纯（德国MERCK公司），水为屈臣氏蒸馏水，其他试剂均为分析纯。

刺五加叶来源于吉林省长白山十五道沟、靖宇县泉阳镇和辉南县小城子村、黑龙江省松江河老松江村和尚志市亚布力镇，共收集10批样品，经我院中药室专家鉴定为五加科植物刺五加的干燥叶。

2.1色谱条件

本试验考察了Sepax Amethyst C18-H（250×4.6 mm，5μm）柱；Waters SunFire C18 （4.6×250 mm，5μm）柱；Agilent Zorbax SB-C18 （250×4.6 mm，5 +m）柱，三种色谱柱在正文色谱条件下，测定同一供试品溶液（长白山十五道沟）；流速：1.0 mL/min；检测波长：354 nm；柱温：35℃；流动相A：0.3%磷酸溶液，流动相B：乙腈，梯度程序如表1所示。

2.2系统适应性考察

在“2.1色谱条件”下，各色谱柱刺五加叶中绿原酸和金丝桃苷的理论塔板数分别为183170、134868、154879，绿原酸与相邻峰的分离度分别为13.263、14.459、15.297，金丝桃苷与相邻峰的分离度分别为1.501、1.623、1.609，且色谱图峰形对称。

2.3对照品溶液的制备

分别精密称取绿原酸和金丝桃苷对照品适量，加甲醇制成绿原酸和金丝桃苷的浓度分别约为0.4 mg/mL和0.08 mg/ mL的混合对照溶液，即得。

2.4供試品溶液的制备

取刺五加叶粗粉（过100目）1.0 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70%乙醇20 mL，称重，超声处理30 min，放冷，再称重，用75%乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，即得。

2.5线性关系考察

精密吸取对照品溶液1μL、2μL、5μL、8μL、10μL、15μL，分别注入液相色谱仪，记录峰面积。

以对照品溶液浓度（μg）为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线，绿原酸标准曲线回归方程为：Y=928163X+76471，r=0.9990，进样量范围为0.39～5.9μg；金丝桃苷标准曲线回归方程为：Y=2131967X-1022，r=0.9999，进样量范围为0.08～1.2μg。

2.6稳定性试验

取刺五加叶（长白山十五道沟村）粗粉1.0 g，精密称定，按照“2.4”项下方法制备供试品溶液，室温下放置，分别于0、2、4、8、12、16、20、24 h进样5μL，依法测定绿原酸和金丝桃苷的峰面积值。结果绿原酸和金丝桃苷峰面积24小时内RSD分别为0.14%和0.22%，表明样品在制备供试品溶液后24 h内稳定。

2.7重复性试验

取刺五加叶（长白山十五道沟村）粗粉1.0 g，精密称取6份，每份约1.0 g，照“2.4”项下方法制备供试品溶液，依法进行测定。结果绿原酸含量为9.52 mg/g，RSD=1.05%；金丝桃苷含量为1.47 mg/g，RSD=1.1%，表明本测定方法的重复性良好。

2.8回收率试验

称取刺五加叶（长白山十五道沟村）粗粉0.5 g，精密称取6份，置具塞锥形瓶中，精密加入高中低浓度的各组分标准溶液，照“2.4”项下方法制备供试品溶液，依法进行测定，计算。结果绿原酸和金丝桃苷的平均加样回收率分别为102.3%和98.4%，RSD分别为0.5%和1.1%。

2.9实际样品测定

分别精密称取5个产地两批次的刺五加叶粗粉各约1.0 g，照“2.4”项下方法制备供试品溶液，具体数据见表2。不同产地样品绿原酸含量范围为1.01 mg/g～10.71 mg/g；金丝桃苷含量范围为0.25 mg/g～1.49 mg/g。吉林省长白山区域基地所产样品含绿原酸及金丝桃苷均较高。

3.1波长

本文采用二极管阵列检测器，其中紫外光谱图显示绿原酸在218 nm和327 nm波长处是最大吸收波长，金丝桃苷在255 nm和354 nm波长处是最大吸收波长。考虑绿原酸在354 nm波长处响应值仍较高，故选择354 nm波长处为测定波长。

3.2供试品制备方法

本文采用了75%乙醇、95%乙醇及75%甲醇和100%甲醇作为供试品提取溶剂，分别超声处理，结果以75%乙醇超声时绿原酸和金丝桃苷的样品含量最高，分别为9.54 mg/g和1.47 mg/g。

同时采用浸泡24小时后超声30分钟、超声30分钟、超声60分钟三种处理方式，结果绿原酸和金丝桃苷的样品含量基本无差距，确定处理方式为操作简便的超声处理30分钟。

【参考文献】

[1]张顺捷，李晓琳.刺五加资源的开发利用[J].中国食品药品监管，2021（5）：108-111.

[2]徐春玲.刺五加叶活性成分研究及其产品开发[D].长春：吉林农业大学，2012.

[3]王晶瑶.刺五加和短梗五加叶及果镇静催眠活性对比研究[D].长春：吉林农业大学，2020.

[4]关欣，秦雯，谢百波，等.一测多评法测定刺五加叶中5个酚类成分含量的研究[J].北京城市学院学报，2021（1）：69-73.

【作者简介】

田国贺，女，1982年出生，副主任药师，研究方向为药品检验与研究。

通讯作者：逄焕欢，女，1977年出生，副主任药师，研究方向为药品检验与研究，邮箱：1480325014@qq.com。

（编辑：侯睿琪）