香蕉皮粉末对黑腹果蝇的引诱活性及挥发物化学成分分析

余 帅,黄 俊,应俊杰,张 娟,毛雪琴,张治军,吕要斌,李 䶮

(1.贵州医科大学 省部共建药用植物功效与利用国家重点实验室,贵州 贵阳 550014; 2.省部共建农产品质量安全危害因子与风险防控国家重点实验室,农业农村部和浙江省植保生物技术重点实验室,浙江省农业科学院 植物保护与微生物研究所,浙江 杭州 310021; 3.仙居县农业农村局,浙江 仙居 317300; 4.浙江省园林植物与花卉研究所,浙江 杭州 311122)

香蕉(Musananalour)为芭蕉科多年生草本植物,在我国的产量位于世界前列。香蕉具有丰富的营养和独特的风味,但食用后产生的大量香蕉皮则会造成环境污染和资源浪费。香蕉皮中含有酚类、油脂类、有机酸、缩合鞣质、蛋白质、果胶和糖类等多种化学成分,具有抗菌、抗氧化、抗肿瘤、降血脂、降血糖等多种生物活性[1-7]。已有研究报道,香蕉果肉对橘小实蝇、黑腹果蝇以及斑翅果蝇成虫均具有明显的引诱作用[8-10],其主要活性物质为乙酸异戊酯、丁酸异丁酯、丁酸丁酯、2-庚醇-乙酸酯、异戊酸异戊酯、戊酸异戊酯和乙酸辛烯酯[11]。然而,香蕉皮对果蝇类害虫的引诱效果还知之甚少。

黑腹果蝇(Drosophilamelanogaster)是浙江省杨梅上为害的主要果蝇种类[12],常常将卵产在成熟果肉下,并逐渐孵化而蛀食果肉及汁液,对杨梅果实的产量、品质以及保质期造成巨大损失,同时还对樱桃、蓝莓、香蕉、葡萄等其他水果造成严重危害[13-14]。本文以黑腹果蝇作为研究对象,采用固相微萃取技术(SPME)分别收集存放不同时间的香蕉皮粉末的挥发物,并利用气相色谱-质谱联用技术(GC-MS)对其挥发物化学成分进行分析;在此基础上,通过室内行为选择测试和大田果蝇种群动态监测进一步验证香蕉皮粉末对黑腹果蝇的引诱效果,以期找到一种经济、环保及有效的引诱成分,为开发引诱剂以绿色防控黑腹果蝇提供理论依据,也为开发香蕉皮的潜在应用价值寻求新的解决途径。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试虫源:黑腹果蝇采自台州市仙居县杨梅园,采用人工饲料进行室内饲养,饲养温度为(25±1)℃,相对湿度为(60±5)%,光周期为16 h∶8 h。

饲养条件:温度23～26℃,相对湿度50%～70%,光周期为14 h∶10 h。本试验选用腹部隆 起的产卵期雌虫作为供试虫源。供试成熟香蕉购自市场,洗净后用于测试。

1.2 实验仪器

用到仪器包括手动SPME进样器,100 μm PDMS萃取纤维头,GC-MS-QP2010Plus型气相色谱-质谱联用仪(岛津)。

1.3 试验方法

1.3.1 固相微萃取样品制备

参照前人研究方法,采用顶空固相微萃取结合GC-MS分析香蕉皮粉末中挥发性化学成分[15]。在气相色谱进样口插入固相微萃取纤维头,在温度250 ℃下保持10 min。取一定量新鲜香蕉皮,切成小块状,放入研钵中研磨成粉状。然后分别称取10 g香蕉皮粉末放入15个50 mL的顶空样品瓶中并密封。每天随机选取3组进行GC-MS分析,连续测定5 d。测试时使用100 μm固相萃取纤维头PDMS进行顶空萃取30 min,收集样品后置于250 ℃解吸3 min进样,并利用气质联用仪进行分析。

1.3.2 气相色谱-质谱(GC-MS)分析条件

香蕉皮粉末的GC-MS图谱经质谱计算机数据系统检索,并利用标准图谱库Nist2005和Wiley275确定各挥发物的化合物结构,同时采用峰面积归一化法确定各成分的相对含量。色谱柱为SH-Rxi-5ms(30 m×0.25 mm×0.25 μm)弹性石英毛细管柱,初始温度为45 ℃,保留2 min,以4 ℃·min-1升至180 ℃,再以8 ℃·min-1升至260 ℃,运行60 min。载气为高纯氦气(99.999%),载气流量1.74 mL·min-1。质谱条件:电子能量70 eV,离子源为EI源,EI源温度230 ℃,发射电流34.6 μA,四极杆温度250 ℃,倍增器电压1 482V,质量范围29～500 amu。

1.3.3 室内行为测定

参考前人研究植物精油对黑腹果蝇的驱避和引诱活性的测定方法[16]。本研究采用笼罩法测定在样品瓶中发酵1、3、5 d的香蕉皮粉末对黑腹果蝇的行为选择反应,以人工饲料作为对照,同时比较发酵1 d和3 d之间的样品。每个处理放入香蕉皮粉末或人工饲料的量为5 g,每次放入单独一只黑腹果蝇成虫,并观察5 min,进入某一侧的成虫视为对该侧气味源具有行为选择性。再以市售3-甲基丁酸丁酯(上海阿拉丁生化科技股份有限公司生产,纯度>98.0%)作为处理进行引诱测试,使用正己烷将3-甲基丁酸丁酯配置成质量浓度分别为1、10、100、1 000 μg·mL-1的工作液,分别测定不同质量浓度3-甲基丁酸丁酯对黑腹果蝇的引诱活性。每组测定20只黑腹果蝇成虫,区分雌、雄虫,每组4次重复。

1.3.4 大田动态监测

参照前人研究方法对杨梅果蝇种群发生动态进行监测[17],监测时段为4月初至5月中旬,监测地点为浙江省台州市仙居县浮石园村和西炉村。将香蕉皮研磨成粉末,取10 g置于自制引诱瓶(550 mL蒸馏水瓶并在中上部开孔)中,并选择挂于杨梅树不同方位的枝条上。根据前期室内对香蕉皮粉末挥发物的测定结果,引诱瓶内的样品每3 d换一次,每个监测点设6个重复,连续监测40 d,并每天观察和记录诱瓶内黑腹果蝇的数量。

1.4 数据处理

采用SPSS 23、Excel 2010进行数据统计分析,行为选择实验数据采用χ2检验(P<0.05)分析。

2 结果与分析

2.1 气相色谱-质谱分析结果

从处理第1天的香蕉皮粉末中鉴定出19种挥发性物质,占总成分的87.56%(图1-A);从第2天的香蕉皮粉末中鉴定出14种成分,占总成分的89.90%(图1-B);从处理第3、4、5天的香蕉皮粉末中均鉴定出5种成分,占总挥发物比例分别为64.86%、69.33%及68.21%(图1-C、D、E)。随着处理时间的延长,香蕉皮粉末中的挥发性物质以及含量逐渐发生变化(表1)。

由表1可以看出,处理第1天的主要成分为3-甲基丁酸丁酯(56.79%)、丁酸(6.30%)、丁酸丁酯(5.36%)、1-甲基丁酸己酯(3.97%)、1-甲基丁酸丁酯(3.24%)、丁酸己酯(2.75%)、3-甲基丁酸丙酯(2.26%)、1-甲基乙酸丁酯(1.69%)以及乙酸异戊酯(0.91%)。第2天的主要成分为3-甲基丁酸丁酯(40.25%)、2-甲基乙酸丙酯(8.62%)、2-甲基丁酸丙酯(7.45%)、1-丁醇-3-乙酸甲酯(7.29%)、1-甲基丁酸丁酯(6.44%)、1-甲基丁酸己酯(6.31%)、3-甲基丁酸丙酯(4.97%)、乙酸仲辛酯(2.37%)、己酸异戊酯(2.10%)、丁酸丁酯(2.04%)、丁酸己酯(1.21%)。第3天的主要成分为正十六烷酸(39.37%)、3-甲基丁酸丁酯(9.62%)、油酸(9.60%)、硬脂酸(3.91%)、十五烷酸(2.36%)。第4天的主要成分有胆固醇(27.11%)、十六烷(25.32%)、壬二烷(12.88%)、癸醛(2.66%)、3-甲基丁酸丁酯(1.36%)。第5天的主要成分为正十六烷酸(20.35%)、癸醛(11.31%)、3-甲基丁酸丁酯(4.32%)、1-甲基十二胺(3.04%)。通过连续5 d的GC-MS分析结果表明,香蕉皮粉末挥发物中的芳香物以酯类居多,并以3-甲基丁酸丁酯为共同成分,处理第1天含量达到56.79%,第2天降为40.25%,处理第3、4、5天的3-甲基丁酸丁酯的含量分别降至9.62%、1.36%、4.32%。由此可见,随着处理时间的延长,3-甲基丁酸丁酯的含量发生显著性变化。

2.2 室内行为选择测定

2.2.1 香蕉皮粉末对黑腹果蝇雌、雄成虫的行为选择

在香蕉皮粉末测试剂量为5 g时,黑腹果蝇雌、雄成虫的行为选择结果如图2所示。处理第1天的香蕉皮粉末对雌虫的引诱率为62.50%,而仅有37.50%的选择对照,二者之间差异显著(P<0.05);对雄虫的引诱率为60.00%,而对照为40.00%,二者之间差异显著(P<0.05)。第3天的行为反应结果显示,雌、雄虫选择香蕉皮粉末的分别为47.50%和50.00%,与之对应雌、雄虫对照组的选择性分别为52.50%和50.00%,两两之间均无显著差异(P>0.05)。第5天,香蕉皮粉末对雌、雄虫的引诱活性均显著低于对照,分别为40.00%和37.50%,有60.00%和62.50%的选择对照(P<0.05)。进一步对处理第1天和第3 天的香蕉皮粉末进行行为选择测试,结果发现,处理第1天对雌、雄虫的引诱率为61.35%和57.50%,而第3天对雌、雄虫的引诱率为38.80%和42.50%,两两之间具有显著性差异(P<0.05)。

*表示两者之间差异显著(P<0.05)。* Indicates significant difference between treatments (P<0.05).图2 黑腹果蝇雌、雄虫对香蕉皮粉末的行为选择Fig.2 Behavioral selection responses of Drosophila melanogaster females and males to banana peel powder

2.2.2 化合物3-甲基丁酸丁酯对黑腹果蝇雌、雄成虫的行为选择

由图3可以看出,3-甲基丁酸丁酯对黑腹果蝇雌、雄成虫均产生较强的引诱活性,并且随着质量浓度的增大引诱活性增强,其中对雌性成虫的引诱活性高于雄性成虫;当质量浓度为1 000 μg·mL-1时,3-甲基丁酸丁酯对雌、雄成虫的引诱率分别达到71.25%和66.25%。

*、**和***分别表示两者之间P<0.05、P<0.01和P<0.001。*, ** and *** indicate P<0.05, P<0.01 and P<0.001 between treatments, respectively.图3 黑腹果蝇雌(A)、雄虫(B)对不同质量浓度3-甲基丁酸丁酯的行为选择Fig.3 Behavioral selection responses of Drosophila melanogaster females (A) and males (B) to different mass concentrations of butyl isovalerate

2.3 香蕉皮粉末监测果蝇动态

由图4可以看出,香蕉皮粉末在室外对黑腹果蝇具有较好的引诱活性,两个监测点整个监测时期平均每瓶诱到的黑腹果蝇数量分别为48.83头和57.33头,在4月底或5月初达到高峰期,平均每瓶诱到的黑腹果蝇数量分别为97.30头和159.80头。从图4中还能看出,这两个杨梅园的黑腹果蝇发生动态,即前期数量呈现较为平稳趋势,而在后期达到高峰值,其后数量逐渐降低。

图4 香蕉皮粉末对黑腹果蝇的大田监测效果Fig.4 Field monitoring effects of banana peel powder on Drosophila melanogaster

3 讨论

杨梅是我国的一种特有水果,深受人们喜爱,也是受黑腹果蝇为害最严重的水果之一,发生为害虫果率高达60%。当前不乏有一些生产者违规使用农药防治杨梅果蝇,给食品安全带来了严重隐患。因此,如何绿色防控杨梅果蝇已成为杨梅安全生产的当务之急,而通过研发引诱剂以高效监测与诱杀果蝇是实现其绿色防控的有效手段。目前有很多学者研究香蕉中的活性成分并对其中一些活性物质的提取方式不断优化,最终应用于害虫的防控[18-21]。已有研究表明,香蕉不同部位或是组织对昆虫具有不同程度的引诱性。例如,香蕉花的挥发性成分对果蝇和家蝇等具有吸引作用[22];香蕉果肉可对橘小实蝇成虫以及切割潜蝇茧蜂雌、雄成虫产生明显引诱活性,而且果实成熟度越高则引诱性越强,同时发现香蕉叶片对这些昆虫也有一定引诱活性[23-25];剥皮香蕉可对红棕象甲产生一定的引诱作用,成熟香蕉可对剑麻象甲具有显著的引诱活性[26-27]。

本研究发现,香蕉皮粉末中主要的挥发性物质为丁酸酯类化合物,其中3-甲基丁酸丁酯含量达到56.79%。Maia等[28]从菠萝蜜的香气挥发物中鉴定出3-甲基丁酸丁酯,且含量达到25.6%,保留时间为10.47 min,与本研究结果存在一定差异,可能是由于升温条件略有不同所导致。而且随着处理时间的延长,其含量总体呈递减的趋势,第5天的含量降至4.32%,而随之产生的是癸醛、正十六烷酸等脂肪族类物质。进一步研究发现,处理第1天的香蕉皮粉末对黑腹果蝇雌、雄成虫均具有显著引诱性,且雌虫的选择反应略高于雄虫,而到第3天和第5天则无引诱活性。而且商品化的3-甲基丁酸丁酯对黑腹果蝇雌、雄成虫均产生较强的引诱活性,并且随着质量浓度的增大引诱活性增强。因此,我们认为香蕉皮粉末在处理短期内所释放的大量3-甲基丁酸丁酯(56.79%)是吸引黑腹果蝇的主要活性物质。张璇[29]研究表明,香蕉和草莓中挥发性成分对黑腹果蝇和斑翅果蝇以及寄生蜂具有引诱活性,乙酸异戊酯、异戊酸乙酯、丁酸异戊酯、丁酸乙酯和乙酸乙酯均被证明为引诱活性物质。此外,香蕉皮原料中挥发性的丁酸丁酯、丙烯酸丁酯和丙酸丁酯等丁酸酯类化合物对绿盲蝽、黑盲蝽、苜蓿盲蝽和三点盲蝽等蝽属害虫均具有引诱活性,而且丁酸丁酯对绿盲蝽产生的引诱活性最强[30-32]。而丁酸丁酯、乙酸丁酯或乙酸异戊酯等活性物质对Oplostomusharoldi和黄地老虎雌性成虫具有吸引作用[33-34],由2-甲基丁酸丁酯、乙酸己酯、己酸丙酯、丙酸己酯、己酸丁酯和丁酸己酯组成的混合物可对苹果实蝇产生较好的引诱活性[35-36]。

进一步通过香蕉皮粉末的野外监测试验发现其对黑腹果蝇具有较好的引诱效果,该监测点黑腹果蝇数量动态趋势表明,4月初期杨梅处于青果时期,黑腹果蝇数量较少,发生数量平稳,而后期随着杨梅逐渐成熟,黑腹果蝇逐渐增多,直到后期,其数量又逐渐下降。来源于自然界的挥发性成分在害虫行为调控和“推-拉”策略防治害虫中发挥着重要作用,已有尝试将香蕉皮和香蕉果肉作为害虫的引诱剂原料,并与毒饵组合使用,达到对大蜡螟和德国小蠊等害虫更佳的诱杀效果[37]。在今后的研究中,可进一步以香蕉皮粉末中挥发物组分作为味源,继续深入研究具体化合物对黑腹果蝇的行为以及相关调控机制,更进一步发明出合适的引诱剂和驱避剂,为开发植物源潜在引诱剂或与性信息素结合进行种群监测和诱杀提供科学依据。