紫草素通过调控ERK1/2-NF-κB通路改善2型糖尿病小鼠肝损伤

马会会　王艳明　何文君　祁婧茹　马克涛

摘要：目的 本研究利用網络药理学及分子对接技术，探究紫草素改善2型糖尿病（T2DM）小鼠肝损伤靶点及机制。方法 利用靶点数据库及疾病数据库挖掘紫草素药物靶点及T2DM肝损伤疾病靶点，韦恩交集法收集紫草素-T2DM肝损伤的共有靶点，String数据库构建蛋白互作（PPI）网络，Glue－GO及Metascape数据库分析Biological Process及KEGG。AutoDock进行分子对接。ELISA检测血清丙二醛（MDA）、天冬氨酸转氨酶（AST）、丙氨酸转氨酶（ALT）含量，HE染色观察肝脏形态，Q－PCR检测炎症因子及抗氧化酶基因表达，Western blot检测细胞外调节激酶1/2（ERK1/2）、p－ERK1/2、磷酸化核转录因子-κB（p－NF-κB）、NF-κB等蛋白表达。结果 紫草素与T2DM肝损伤的共有靶点105个，36%共有靶点富集在“regulation of inflammatory response”生物学过程，KEGG 信号通路主要涉及“AGE－RAGE signaling pathway in diabetic complications”等炎症通路。紫草素与ERK1/2、c－Jun氨基末端激酶（JNK）、蛋白激酶B（AKT）有较好的对接活性。体内动物实验结果显示，与模型组相比，紫草素显著减少肝脏组织炎性颗粒细胞浸润，抑制脂质空泡形成，减少血清MDA、AST、ALT含量（P<0.05），上调SOD1、SOD2、CAT抗氧化酶基因表达（P<0.05），下调p－ERK1/2/ERK1/2、p－NF-κB/NF-κB及IL-1β等炎症因子表达（P<0.01）。结论 紫草素能通过增加抗氧化酶基因表达及抑制ERK1/2-NF-κB信号通路改善T2DM肝损伤。

关键词：紫草素；肝损伤；2型糖尿病；网络药理学；分子对接

中图分类号：R966中图分类号文献标志码：A文献标识码

Shikonin ameliorate the hepatic injury of type 2 diabetes mellitus mice by regulating ERK1/2-NF-κB signaling pathway

MA  Huihui1，WANG  Yanming1，2，HE  Wenjun1，QI  Jingru1，MA  Ketao1，2*

（1 School of Medicine/Ministry－of－Education Key Laboratory of Xinjiang Endemic and Ethnic Diseases， Shihezi University，

Shihezi，Xinjiang 832000， China; 2 The First Affiliated Hospital， School of Medicine/NHC Key Laboratory of Prevention and Treatment of Central Asia High Incidence

Diseases， Shihezi University， Shihezi，Xinjiang 832000， China）

Abstract： Objective The study used the network pharmacology and molecular docking to explore the potential targets and the possible mechanisms of Shikonin for improving the type 2 diabetes mellitus （T2DM） with liver injury. Method The targets of Shikonin and the disease targets of hepatic injury of T2DM were collected by different databases， and the Wenn was used to collect the overlap common targets of Shikonin－hepatic injury of T2DM， and String database was used to build the protein and protein interaction （PPI） network， and Clue－GO and Metascape database were used to analysis the Biological Process and KEGG pathways， and AutoDock was used for molecular docking. ELISA was used to detect the level of malondialdehyde （MDA）， aminotransferase （AST） and aminotransferase （ALT） in serum， and HE staining was used to observe liver histomorphology， and Q－PCR was used to detect the mRNA expression of inflammation factors and anti－oxidant enzymes， and Western blot was used to detect the protein expression of extracellular signal regulated kinase1/2 （ERK1/2）， p－ERK1/2， phosphorylated nuclear factor-κB （p－NF-κB）， NF-κB and so on. Result The common targets of Shikonin and T2DM with hepatic injury was 105， and 36% of common targets was enriched at the Biological Process of inflammatory response regulation， and the common targets mainly enriched at the related inflammation KEGG pathway， including “AGE－RAGE signaling pathway in diabetic complications” and so on. There was good docking binding activity between Shikonin and c－Jun N－terminal kinase （JNK）， protein kinase B （AKT）， ERK1/2. In the model of T2DM mice， compared with the model group， Shikonin significantly decreased the level of MDA， AST and ALT in serum （P<0.05）， and inhibited the inflammatory particle cell infiltration and reduced lipid vacuolation in liver tissue， and upregulated the mRNA expression of anti－oxidant enzymes SOD1， SOD2 and CAT （P<0.05）， and downregulated the protein expression of p－ERK1/2/ERK1/2， p－NF-κB/NF-κB， IL-1β and so on （P<0.05）. Conclusion Shikonin can significantly improve the hepatic injury in type 2 diabetic mice by inhibiting ERK1/2-NF-κB signaling pathway and upregulating the gene expression of anti－oxidant enzymes. Shikonin might be a potential drug for protecting liver.

Key words： Shikonin;hepatic injury;type 2 diabetes mellitus;network pharmacology;molecular docking

近年来，2型糖尿病（T2DM）患病率在我国呈逐年增加趋势，其是由胰岛素分泌相对不足或胰岛素抵抗引起的糖脂代谢紊乱，引起肝脏、肾脏等多个脏器功能紊乱的慢性代谢性疾病［1］。非酒精性脂肪肝、肝炎、肝硬化等肝脏疾病是T2DM常见并发症。T2DM并发的肝脏疾病发生机制极其复杂。例如糖脂代谢紊乱引起的肝脏脂质过度积累，可诱导炎症因子释放，同时引起氧化应激，加剧肝脏损伤、坏死、纤维化，甚至发展为肝癌［2］。肝脏是机体重要的胰岛素靶器官，肝脏病变又会进一步加剧糖代谢紊乱，加速糖尿病发生发展，这也是导致T2DM患者生活质量下降，病死率高的原因之一［3］。

紫草素（Shikonin）被称为左旋紫草醌，是新疆特色植物药紫草（Arnebia euchroma （Royle）Johnst.）中天然醌类化合物。现已明确紫草具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤等药理活性［4］。研究显示，紫草素可降低血糖水平［5］，增强肌肉及脂肪细胞葡萄糖摄取能力［6］。此外，紫草素对糖尿病引起的视网膜病变及高糖诱导的肾小管上皮细胞损伤有改善作用［7-8］。这些研究说明紫草素对T2DM及其并发症有潜在治疗作用，但紫草素是否对T2DM肝损伤有保护作用仍不明确。因此本研究旨在探究紫草素对T2DM肝损伤的保护作用及可能靶点机制，为深入挖掘新疆特色植物药紫草中单体化合物紫草素的药用价值提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

40只8周龄雄性C57BL/6J小鼠，体重量（23±2g），购于上海斯莱克实验动物有限公司，生产许可证号：SCXK（沪）2017-0005。喂养于石河子大学动物实验饲养中心，动物实验已通过石河子大学医学院第一附属医院实验动物伦理委员会审定［批准编号：A2021-014-01］。

1.2 试剂

紫草素购于上海源叶生物科技有限公司（批号：R18D8F50911）；链脲佐菌素（streptozotocin，STZ）购于上海金穗生物科技有限公司（批号：WXBD4971V）；辣根过氧化物酶（HRP）-羊抗鼠免疫球蛋白（Ig）G，HRP-羊抗兔 IgG购买于武汉三鹰生物技术有限公司（批号：BA1050，BA1055）；血糖试纸购于罗氏诊断产品上海有限公司（批号：05234450032）；二甲双胍购于上海源叶生物科技有限公司（批号：S24O8G46081）；丙二醛（MDA）、天门冬氨酸氨基转移酶（AST）、丙氨酸氨基转移酶（ALT）试剂盒购于南京建成有限公司（批号：20220617，20220615，20220509）。实时荧光定量SYBR Green PCR试剂盒购于日本Takara责任有限公司（批号：AI21771A）；cDNA 逆转录试剂盒购买于美国赛默飞生物科技有限公司（批号：00705427）。细胞外调节激酶1/2（ERK1/2）、p－ERK1/2、磷酸化核转录因子-κB（p－NF-κB）、NF-κB、白细胞介素-1β（IL-1β）、IL-6、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）购于Abcam公司（批号：GR3204823-5，GR3204822-12，GR3204852-24，GR3236514-1，GR300276-44，GR3242312-1，GR2654376-3）。

1.3 仪器

全自动生化分析仪（北京科力怡达技术有限公司，Olympus AU400型），实时荧光定量PCR仪（罗氏生物公司，Roche lightcylcer@96型），北京六一电泳仪（北京六一生物科技有限公司，型号：DYCZ-40G），北京六一电转仪（北京六一生物科技有限公司，型号：DYCZ-24DA）。

1.4 方法

1.4.1 紫草素-T2DM肝损伤靶点的收集及PPI网络建立

利用SEA、QSAR、Swiss、BATMAN、Symmap数据库搜索化合物Shikonin对应靶点。利用DisGeNET、GeneCard疾病数据库输入“type 2 diabetes”、“obesity”、“liver injury”、“liver insulin resistance”、“liver lipid metabolism”五个关键词，利用Draw Venn Diagram数据库收集共有疾病靶点，再将紫草素药物靶点与T2DM肝损伤疾病靶点共交集，利用Cytoscape3.7.1软件构建紫草素靶点及T2DM肝损伤疾病靶点网络。将共有靶点放入String数据库，设置organisms为Homo Sapiens，最低要求互动分数为0.4，获取紫草素-T2DM肝损伤蛋白互作网络（protein－protein interaction，PPI），Cytoscape3.7.1软件分析并构建PPI网络。

1.4.2 GO功能富集分析及 KEGG 通路富集分析

将共有靶点导入Cytoscape3.7.1软件中Clue GO 模块，设置“Show only Pathways with pV ”≤ 0.5，运行Glue GO Functional Analysis富集分析。再将共有靶点导入Metascape数据库中，种属设置为“H.sapines”，选择“Custom Analysis”，选择“KEGG pathway”进行通路分析，并根据P值从小自大的原则选择前10条通路，利用Cytoscape3.7.1软件构建KEGG通路网络。

1.4.3 动物喂养及处理

40只小鼠适应性喂养一周后，将小鼠随机分为正常对照组（Normal）、模型组（Model）、二甲双胍组（Met）、低剂量紫草素组（Low）、高剂量紫草素组（High）。正常对照组给予普通饲料喂养。其他组给予高脂饲料（0.3% 胆酸盐，4% 胆固醇，10% 蛋黄粉，10% 猪油，15% 蔗糖，60.7% 基础饲料）喂养8周，于第9周一次性腹腔注射STZ（150 mg·kg-1）构建2型糖尿病模型鼠［9］。通过尾静脉采血，血糖含量大于18.8mmol·L-1，说明模型构建成功［10］。阳性药组每天灌胃给予二甲双胍（250mg·kg-1）［10］。实验组每三天分别腹腔注射低、高剂量紫草素组2.5 mg·kg-1及5 mg·kg-1 紫草素［11］，干預2周后，通过腹腔注射戊巴比妥钠（35mg·kg-1）麻醉，眼球取血，取动物肝脏组织。

1.4.4 HE染色指数及血清MDA、AST、ALT含量检测

取新鲜小鼠肝脏组织置于10%甲醛溶液中，固定48 h，石蜡包埋、切4μm组织薄片，再通过苏木精—伊红（HE）染色，显微镜下观察拍照。取动物血清20μL，并按照试剂盒说明书进行稀释，根据说明书操作检测血清AST、ALT、MDA含量。

1.4.5 Quantitative Real－time PCR法检测炎症因子及抗氧化激酶基因表达

取动物肝脏组织100mg，充分研磨制成10%组织匀浆，按照提取RNA步骤操作提取RNA，检测各组RNA浓度及260/280吸光度比值。所有样本260/280吸光度比值介于1.8至2.0之间。再根据第一链cNDA合成试剂盒逆转录步骤操作，最后根据扩增试剂盒步骤进行扩增。

1.4.6 Western－Blot检测蛋白表达

取动物肝脏组织100mg，充分研磨制成10%组织匀浆，按照蛋白提取试剂盒要求进行操作。BCA法测定蛋白浓度。使用10 % SDS－PAGE凝胶电泳，蛋白上样量为50 μg，再电转2 h，封闭液封闭，加入一抗ERK1/2（1∶800）、p－ERK1/2（1∶800）、NF-κB（1∶1 000）、p－NF-κB（1∶1 000）、IL-1β（1∶600）、IL-6（1∶800）、TNF-α（1∶500）、β-actin（1∶1 000）后， 4℃孵育10 h以上，再加入二抗（1∶5 000）室温孵育1 h，曝光拍照。

1.4.7 统计方法

采用SPSS 19.0统计软件进行数据统计分析，计量资料数据采用均数±标准差（X-±S）表示，组间比较采用 SPSS 中单因素方差分析（one－way ANOVA） ，以P<0.05，P<0.01表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 紫草素药物靶点及2型糖尿病肝损伤疾病靶点的收集

如图1A所示，从SEA、QSAR、Swiss、BATMAN、Symmap五个靶点数据库共收集到215个紫草素药物作用靶点。图1B所示，分别从DisGeNET和GeneCard疾病数据库收集“type 2 diabetes”、“Obesity”、“liver injury”、“liver lipid metabolization”、“liver insulin resistance”疾病靶点，然后再利用韦恩共交集方法确定这5个关键词的共有疾病靶点为1 211个。

2.2 紫草素药物靶点与T2DM肝损伤疾病靶点网络的建立

如图2所示，将紫草素药物靶点与T2DM肝损伤疾病靶点共交集，确定药物与疾病的共有靶点为105个（红色菱形—药物与疾病的共有靶点）。String数据库构建药物-疾病共有靶点交互网络，Cytoscape软件计算PPI网络靶点Degree值、Closeness Centrality值等，根据Degree分值从高至低的方法排序，发现AKT1、STAT3、TNF、IL-6等靶点位于该网络的中心。

2.3 GO及KEGG富集分析

如图3A和3B所示，GO－Biological Process结果显示，紫草素改善2型糖尿病肝损伤的靶点GO主要富集在“regulation of inflammatory response”、“regulation of intrinsic apoptotic signaling pathway”、“regulation of extrinsic apoptotic signaling pathway” 、“cellular response to reactive oxygen species”等生物学过程。其中36%靶点富集在“regulation of inflammatory response”生物学过程，说明紫草素改善T2DM肝损伤与炎症密切相关。Metascape 预测KEGG富集通路（图3C和3D）与Biological Process富集分析结果一致，紫草素改善T2DM肝损伤主要涉及炎症通路，例如“TNF signaling pathway”、 AGE－RAGE signaling pathway in diabetic complications”等。由于肝脏损伤是T2DM常见并发症之一，因此我们重点关注“AGE－RAGE signaling pathway in diabetic complications”信号通路。如图3E所示，在“AGE－RAGE signaling pathway in diabetic complications”通路中，上游细胞外调节激酶1/2（ERK1/2）、蛋白激酶B （AKT）、c－Jun氨基末端激酶（JNK）是NF-κB核因子上游三个靶点，提示紫草素可能通过这3个关键靶点抑制下游NF-κB信号通路改善T2DM肝损伤。

2.4 紫草素与核心靶点分子对接

为进一步明确紫草素与核心靶点的结合能力，利用AutoDock软件将紫草素与核心靶点进行对接，结合能（Affinity）值越小说明结合能力越强。化合物与核心靶点蛋白结合能低于- 5 kcal·mol-1说明两者结合能力良好［18］。如图4所示，紫草素与蛋白激酶B （AKT）（A）、细胞外调节激酶1/2（ERK1/2）（B）、c－Jun氨基末端激酶（JNK）（C）的结合分数分别为-7.1 kcal·mol-1、-8.4 kcal·mol-1、- 7.3 kcal·mol-1 （表2）。

2.5 紫草素对T2DM小鼠体重及空腹血糖的影响

如图5所示，与正常组相比，模型组小鼠体重在给药第0、1、2周体重明显增加（P<0.05；P<0.01）。 与模型组相比，低剂量及高剂量紫草素组小鼠体重无明显变化（P>0.05）。与正常组相比，模型组小鼠空腹血糖在给药第0、1、2周明显增加（P<0.01）。与模型組相比，低剂量及高剂量紫草素组小鼠空腹血糖无明显变化（P>0.05）。

2.6 紫草素对T2DM小鼠肝脏指数、MDA、ALT、AST含量的影响

如图6所示，与正常组相比，模型组小鼠肝脏指数、血清MDA、ALT、AST含量显著增加（P<0.01）。

与模型组相比，低、高剂量紫草素组显著降低肝脏指数、血清MDA及AST含量（P<0.05；P<0.01）。与模型组相比，高剂量紫草素组显著降低血清ALT含量（P<0.01）。

2.7 紫草素对T2DM小鼠肝脏组织形态的影响

如图7结果所示，正常组肝脏组织结构正常，肝窦清晰，肝索排列整齐，肝细胞排列整齐，且肝细胞无脂肪空泡、无炎症颗粒细胞浸润。与正常组相比，模型组肝脏组织结构明显异常，肝索排列紊乱，肝窦结构不清晰，肝细胞大小不均，且有大量炎性颗粒细胞浸润（蓝色箭头所示），并伴有脂质空泡的形成（黑色箭头所示）。与模型组相比，低、高剂量组肝索排列较为整齐，肝细胞脂肪空泡明显改善，细胞内炎性颗粒浸润显著减少。

2.8 紫草素对炎症因子及抗氧化酶基因表达影响

如图8所示，与正常组相比，模型组小鼠肝脏SOD1、SOD2、CAT mRNA表达含量明显减少（P<0.01），诱导型一氧化氮合酶（iNOS）、IL-6、TNF-α、

IL-1β、IFN-γ mRNA表达含量明显增多（P<0.05；P<0.01）。与模型组相比，高剂量紫草素组显著增加CAT mRNA表达（P<0.01）。与模型组相比，低、高剂量紫草素组显著增加SOD1、SOD2 mRNA表达（P<0.05；P<0.01），且明显降低iNOS、IL-6、TNF-α、IL-1β、IFN-γ表达（P<0.05；P<0.01）。

2.9 紫草素对ERK1/2-NF-κB信号通路及炎症因子蛋白表达影响

如图9所示，与正常组相比，模型组p－ERK1/2/ERK1/2、p－NF-κB/NF-κB及炎症因子IL-6、IL-1β、TNF-α蛋白表达含量显著增加（P<0.01）。与模型组相比，低、高剂量紫草素组显著下调p－ERK1/2/ERK1/2、p－NF-κB/NF-κB及炎症因子IL-6、IL-1β、TNF-α蛋白表达（P<0.01）。

3 讨论

目前紫草素研究多集中在药效及药理机制研究。研究报道，紫草素具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤等多种药理活性，且其在不同动物模型的干预方式和时间均不同。Li等人［13］发现，SD大鼠灌胃25mg·kg-1紫草素2 h后，高效液相紫外检测法（HPLC－UV）检测紫草素血浆浓度为0.48μg·mL-1。Yan等人［14］报道，SD大鼠静脉注射5mg·kg-1紫草素，液相色谱-串联质谱联用法（LC－ESI－MS－MS）检测紫草素 t1/2β=630.7 ± 124.9 min，Cmax=83.6 ± 8.8 ng/mL，Tmax=1.0 min，Vd=136.6 ± 10.5 L/kg。由于紫草素口服生物利用度低，本研究通过参考研究者给药方法［11］，腹腔注射给予小鼠低剂量（2.5 mg·kg-1）及高剂量紫草素（5 mg·kg-1），旨在探究紫草素改善T2DM肝损伤的可能靶点及机制。

近期研究显示，紫草素被认为是具有潜在抗糖尿病活性化合物［5］。研究报道，紫草素能抑制iNOS及COX2表达改善糖尿病视网膜病变［7］，其也能通过抗氧化、抗凋亡作用改善高糖诱导肾小管上皮细胞损伤［8］，提示紫草素对胰岛素敏感靶组织器官有保护作用。但紫草素是否对T2DM肝损伤有保护作用，仍不明确。本研究通过体内实验证实紫草素对T2DM肝损伤有保护作用。如图6和图7结果显示，与正常组相比，模型组小鼠MDA、ALT、AST含量显著增加，肝脏组织结构明显异常，肝脏中心静脉明显扩张，肝索排列紊乱，肝窦结构不清晰，大量炎性颗粒细胞浸润在肝小叶组织中，并伴有脂质空泡的形成，说明本研究T2DM小鼠伴有明显的肝损伤。低、高剂量紫草素组显著降低MDA、ALT、AST含量，且显著抑制肝脏组织炎性颗粒细胞浸润，减少脂质空泡形成，说明紫草素对T2DM小鼠肝損伤有改善作用。

2型糖尿病并发肝脏疾病已成为导致患者生活质量低或死亡的一个重要原因。研究显示，T2DM并发的肝损伤发病机制极其复杂，糖脂代谢紊乱、炎症反应、氧化应激等多种因素都是造成肝脏损伤的重要因素［2］。由于T2DM并发肝脏疾病机制复杂且受多种因素影响，因此本研究利用多个疾病数据库及靶点数据库收集T2DM肝损伤疾病靶点及紫草素药物靶点（图1）。GO－BP生物学富集分析及KEGG富集通路结果说明，紫草素改善T2DM肝损伤与炎症密切相关（图3），因此本研究继续通过Q－PCR检测肝脏组织中炎症因子表达。图8和图9所示，与模型组相比，紫草素显著降低炎性因子IL-1β、TNF-α、IL-6、IFN-γ基因及蛋白表达，上调抗氧化酶基因表达，说明紫草素能通过抗炎、抗氧化作用发挥肝脏保护作用。研究报道，过度的炎症因子分泌，会促使氧自由基（ROS）和活性氮（RNS）大量产生，适度氧自由基释放有助于清除毒性物质或异常活跃蛋白及细胞，但过度激活氧自由基也会导致组织氧化应激性损伤［10］。MDA是脂质过氧化的重要产物，其能破坏多不饱和脂肪酸的代谢，造成过多过氧化物的生成，导致组织损伤。iNOS能促进NO生成，引起氧化应激反应［15］。SOD1、SOD2、CAT抗氧化酶能通过清除多余的氧自由基，从而调控氧化还原平衡，对组织起到保护作用［16］。

肝脏炎症是导致肝脏损伤及肝脏胰岛素抵抗重要原因之一。因此，我们重点关注AGE－RAGE signaling pathway in diabetic complications信号通路。如图3E所示，紫草素可通过作用JNK、ERK1/2、AKT靶点，抑制下游NF-κB信号通路。图4分子对接结果显示，紫草素与JNK、ERK1/2、AKT对接分数均小于-5 kcal·mol-1，说明紫草素与3个关键靶点蛋白结合活性良好，其中与ERK1/2的结合能力最佳。AKT、JNK、ERK1/2是介导炎症信号通路的关键蛋白。Akt（也被称为蛋白激酶B或PKB）是由AKT1、AKT2、AKT3 3个亚基组成。其中AKT1对调控炎症、代谢相关信号通路及调节机体细胞内外生物学过程有重要作用。研究报道，缺失AKT1能促进诱导型iNOS合成酶及M1型促炎症因子增加。反过来增强AKT1表达能减少促炎因子的生成，恢复M1型（促炎）及M2型（抗炎）极化的平衡［17］。JNK能通过在N-末端Ser63和Ser70磷酸化增强c－JNK转录活性，介导炎症及氧化应激的发生［18］。

研究报道，ERK1/2能介导单核细胞、巨噬细胞等炎性细胞的信号转导，参与调控哮喘、类风湿性关节炎等多种炎症性疾病的发生发展［19］。抑制ERK1/2活性或siRNA敲出ERK1/2基因可增强LPS介导的炎性反应，反向激活ERK1/2活性可有效抑制IL-1β介导的炎症反应［19-20］。ERK1/2能通过磷酸化c－Fos介导炎症因子的产生，其也能直接磷酸化IKK及P65磷酸化激活NF-κB［21］。NF-κB是炎症反应的主要调控因子，其能调控下游IL-1β、TNF-α、IL-6、IFN-γ等炎症因子网络。目前有研究认为，抑制NF-κB调控的炎症网络是临床治疗疾病的前景策略之一［22］。Zhang等［23］报道，毛兰素能下调GLUT1介导的葡萄糖摄入能力，抑制ERK1/2介导的NF-κB炎症信号通路，减少促炎细胞因子TNF-α的产生，改善糖尿病视网膜病变。Li等［24］报道，甘草甙能通过激活 Nrf2/Keap1活性，抑制ERK1/2-NF-κB信号通路，改善皮质酮诱导的神经损伤。本研究结果与这些报道一致。图8和图9结果所示，紫草素浓度依赖性抑制IL-6基因及蛋白水平表达，但对TNF-α、IL-1β及IFN-γ表达无浓度依赖抑制作用。由于T2DM并发肝损伤机制复杂，涉及糖脂代谢紊乱、炎症、氧化应激等多个信号通路，且本研究利用网络药理学收集紫草素改善T2DM肝损伤的靶点共105个（图2），这提示紫草素不仅能通过ERK1/2-NF-κB信号通路抑制炎症因子表达，其可能还存在其他靶点及机制调控下游炎症因子，后期仍將进一步深入挖掘靶点并验证。

综上所述，本研究通过网络药理学及分子对接技术筛选紫草素改善T2DM肝损伤的靶点及机制，再通过体内实验验证，发现紫草素能增加抗氧化激酶基因表达，抑制ERK1/2-NF-κB信号通路，改善T2DM小鼠肝脏损伤，这些研究结果提示紫草素是一种潜在的肝保护药物，这也为新疆特色植物药紫草中单体化合物紫草素的药理活性提供新的参考价值。目前针对紫草素研究多为药用机制报道，毒理相关研究较少，且研究不够深入，缺少药代动力学数据支撑。更多学者希望能通过开发紫草素纳米药物递送系统，如纳米颗粒或嵌合高级药物递送纳米系统，以提高紫草素生物利用度及治疗效果［14］，这可为紫草素的药用开发及临床利用提供新的前景策略。

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（責任编辑：编辑唐慧）

收稿日期：中文收稿日期2023-03-24

基金项目：国家自然科学基金项目（82260492）；新疆生产建设兵团“天山英才”项目；石河子大学高层次人才科研启动项目（RCZK202030）；石河子大学自主资助校级科研项目（ZZZC303014A）

作者简介：马会会（1993—），女，硕士研究生，专业方向为生理学与病理生理学。

*通信作者：马克涛（1979—），男，教授，从事心脑血管疾病机制研究，e－mail：maketao@hotmail.com。