肾损伤标志物N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶检测方法的研究进展

李志恒, 徐瑞平,2, 王思懿, 肖炳坤, 杨建云, 缪潇瑶, 黄荣清,2*

(1.军事科学院军事医学研究院辐射医学研究所, 北京 100850; 2. 广东药科大学中药学院, 广州 511436)

肾脏是人体重要器官,它主要起到维持体液和电解质平衡的作用,可以将部分外源性物质和代谢废物经尿液排出体外。由于肾脏是药物代谢的主要场所之一,而药物毒性是导致器官损伤的重要因素,因此肾脏疾病普遍具有较高的发病率[1-2]。药物引起的肾损伤包括急性肾损伤(acute kidney injury,AKI)和慢性肾损伤(chronic renal injury,CKD),AKI以肾功能急剧下降为特点,表现为血肌酐快速升高和尿量减少等症状[3-5];CKD表现为肾小球滤过率降低和尿白蛋白排泄增加等[6-8]。肾损伤是一个严重的公共健康问题,然而目前对肾损伤的诊断检测方法如测定血肌酐和尿量等,对于AKI和CKD的早期诊断并不敏感,导致疾病不能得到及时治疗,部分CKD向AKI转化,甚至引起器官衰竭等并发症导致患者死亡[9]。因此在早期阶段及时发现肾损伤并对损伤的发展进行实时监测,对于肾脏疾病的治疗具有十分重要的意义[10]。

生物标志物[11]是指可以标记系统、器官、组织、细胞及亚细胞结构或功能的改变或可能发生的改变的生化指标,具有非常广泛的用途,可用于疾病诊断、判断疾病分期或者用来评价新药的安全性和有效性[12-13]。病理学研究已发现多种肾损伤的生物标志物[14-16],并且某些标志物的表达在病症早期即可发生显著变化[17-19],可用于肾损伤的早期检测。其中,N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(N-acetyl-β-D-glucosaminidase, NAG)是近端肾小管上皮细胞的溶酶体中发现的最活跃的糖苷酶,它通过催化糖蛋白中的末端葡萄糖残基进行水解[20]。由于其相对分子质量大于70 kDa,不能通过肾小球渗透正常进入尿液[21-22],因此尿中NAG活力的升高是临床上肾脏损害的一个重要指标[23-24]。便捷、简单和精确的NAG活力检测技术,是目前肾脏疾病研究领域的一个热门方向。目前NAG活力检测的方法主要有比色法、毛细管电泳法、荧光探针和电化学法等。

1 比色法和荧光探针法

比色法和荧光探针法作用原理相同,这两种检测方法,都是显色底物与载体连接,载体在与酶结合裂解后释放出显色底物,并产生可检测的颜色或荧光[25-26]。

比色法中常见的显色底物包括对硝基苯基-N-乙酰基-β-D-氨基葡萄糖(P-nitrophenyl-N-acetyl-β-D-glucosamine, pNP-NAG)[27]、2-甲氧基-4-(2′-硝基乙烯基)-苯基2-乙酰氨基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖苷[2-methoxy-4-(2′-nitrovinyl)-phenyl-2-acetylamino-2-deoxy-β-D-glucopyranoside, MNP-GlcNAc][28-29]、苯酚偶联N-乙酰氨基葡萄糖(phenol coupledN-acetylglucosamine,PIP-NAG)[30]等。虽然这些显色底物在检测酶活性时得到了广泛应用,但这些显色底物极易出现背景干扰如与尿液或血液中的多种成分具有相似的吸收,故而在诊断应用中是有限的。

比色检测法主要用于实验室酶联免疫吸附实验测定NAG含量。具有成本低廉、操作简便等优点,但总体而言,大多数显色底物的检测限较高,反应速率也比较低,检测过程中需要较高的底物浓度和较长的孵育时间。目前其发展趋势是研发长波吸收的易裂解比色底物,以提高检测的灵敏度和准确率。

基于含荧光素的显色底物在生命科学中是一种常见的荧光探针,荧光探针法是与显色底物与酶裂解后释放强烈的荧光讯号,相较于比色法,荧光探针法的灵敏度[41]、反应速率、亮度、生物相容性都高于传统的比色法。

张珩[31]巧妙地将比色法中测定吸光度转化为测定荧光强度,利用水热法合成了绿色荧光碳点(carbon dots, CDs),其最大激发峰(415 nm)与对硝基苯酚(pNP)重叠,当体系内同时存在CDs和pNP时,由于荧光内滤效应(inner filter effect,IFE)[32]使碳点发光淬灭,在提升灵敏度的同时减少了尿液或血清的背景干扰。其中CDs是一种具有良好生物相容性的纳米材料,研究人员还在探索将其用作药物载体,实现对肾脏疾病的一体化诊疗[33]。Linko-Löppönen等[34]为扩大适用性,以4-MU-GlcNAc为荧光底物,建立了基于荧光探针法的离心式微流控平台,可自动化完成样本传输、计量、混合和荧光测定等一系列步骤,实现于临床大批量样品检测[35]。为了精准检测体内NAG含量,Yan等[36]开发了酶激活荧光探针(NHPO)用于顺铂诱导的肾损伤小鼠体内成像和对肾损伤患者的尿液样本进行检测(图1),NHPO在体内具有高灵敏度和高选择性,适用于复杂生物系统中的NAG检测,虽然NHPO可以进行活体实时成像,但其在部分荧光通道中没有响应,因此急需检测范围更广的体内NAG活性检测荧光探针。Tan等[37]通过将二吡咯亚硼与聚合物基质mPEG-DSPE引入近红外荧光分子中,制备了水分散纳米探针BOD-II-NAG-NP,将NAG荧光探针的发射光谱拓展至第二近红外窗口区域(the second near-infrared window region,NIR-Ⅱ),为1 000～1 700 nm,相比可见发光的荧光探针具有更好的空间分辨率、更高的信噪比和更深入的组织穿透能力[38-39],获得了更好的成像效果[40],实时NIR-Ⅱ荧光成像更清晰,产生的背景噪声更少,BOD-Ⅱ-NAG-NP具有成为临床监测肾损伤精密传感器的潜力。荧光探针法的发展前景是检测多种目标物,可以在同一样本中进行多种检测[41-42],降低对于样本评价的误差,减少了样本需要量,提高肾脏损伤早期及时发现和精确诊断。

图1 荧光探针与NAG作用机理Fig.1 Mechanism of interaction between fluorescence probe and NAG

2 毛细管电泳法

毛细管电泳法是以毛细管作为分离载体、高压电场作为驱动力,基于样品中各组分之间淌度和分配行为上的差异而实现混合体系分离的一种分析方法,具有快速、高效和低耗等优点[43]。Friedberg等[44]将尿样与底物甲基伞形花环-β-D-氨基葡萄糖苷混合后直接进样检测,当尿液中存在NAG时,紫外/荧光检测器可以检测到反应产物4-甲基伞形酮,在给药和其他尿液的干扰下,在1.4～23 U/L表现出良好的线性关系。

毛细管电泳法是对比色法和荧光探针法的一种改进,通过增加一个混合体系分离的步骤,减少了背景干扰,进一步提高了检测的灵敏度[45]。但是底物和待测样品的极性、缓冲液类型、pH等因素对分离效果有较大影响,在探索分离条件的过程中需要耗费大量精力,且对检测灵敏度的提高有限,在NAG检测中应用较少。

3 电化学法

电化学法是建立在物质在溶液中的电化学性质基础上的一类仪器分析方法,通常将样品溶液作为化学电池的一个组成部分,并将电池的某种电参数(如电阻、电导、电位、电流、电量或电流-电压曲线等)与被测物质的浓度建立起联系,通过电信号数据对待测物质进行定量分析[46]。Pemberton等[47]将底物1-萘基-N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷修饰到丝网印刷电极(screen-printed carbon electrode,SPCE)上,在NAG催化下底物氧化裂解,电位差发生变化,从而对NAG活力进行定量分析。该电极制备简单、成本低廉、可批量生产,不需要预处理且一次性使用,可避免交叉污染[48]。Vibulcharoenkitja等[49]基于掺硼金刚石(boron-doped diamond,BDD)圆盘传感器,使用阳极微分脉冲伏安法(differential pulse voltammetry, DPV),利用三电极装置(BDD工作电极、铂板和用于伏安检测的Ag/AgCl/3 mol/L KCl参比电极)灵敏监测NAG含量。三电极装置将产生的游离4NP转化为可量化的电信号,以便计算尿样中的NAG活力(图2)。在传感器内添加了数值评价,伏安酶分析方法成功使用可批量生产的丝网印刷BBD磁盘传感器平台的尿液NAG检测。

图2 BDD与NAG作用机理[49]Fig.2 BDD sensing method for detecting NAG in urine of patients with suspected renal damage[49]

电化学法所用的仪器设备体积小、构造简单、价格低廉[50],可作为便携式读数设备进行常规分散临床测试,有望发展居家便携式的检测设备,方便患者及时进行早期诊断,与后续监测。

4 电化学发光法

现代技术中,基于发光的分析要明显优于比色法和荧光探针法,发光主要的优点在于不需要外部光源的照射,因此其背景干扰低,灵敏度高,对于特定的酶做出反应而发光[51-52]。

电化学发光(electrochemiluminescence,ECL)是在电极上施加一定的电压使电极反应产物之间或电极反应产物与溶液中某组分进行化学反应而产生的一种光辐射[53]。自增强电致发光是一种新的提高发光效率的电致发光反应模式,它通过共价连接使发光团及其共反应基团存在于同一分子中[54],具有能够缩短电子传输距离、提高发光稳定性、简化操作、减少测量误差等优势。联吡啶钌[Ru(bpy)32+,其中bpy表示2,2′-联吡啶(2,2′-bipyridyl)]由于其在水介质中的高度稳定性、良好的化学性能以及多种共反应物的相容性使其成为研究最多的无机ECL发光体[55]。Wang等[56]以Ru(bpy)32+为发光单元,采用溶剂蒸发诱导自组装法制备了发光效率较高的纳米棒{[Ru(bpy)2(mcbpy)2+-TAPA]NRs}。将功能化的铂纳米颗粒[Ru(bpy)2(mcbpy)2+-TAPA]NRs用于负载检测抗体(Ab2),并合成了具有层次支化结构的Au/Pd树枝状大分子(dnedrimers,DRs),以增加固定化捕获抗体(Ab1)的量。NAG浓度在0.5～1 pg/mL范围内线性关系良好,检测限为0.17 pg/mL。同年该课题组开发了Ru(Ⅱ)络合物{[Ru(dcbpy)2dppz]2+-DPEA}的光开关分子[57]。以Y形DNA为原料制备了DNA树状大分子(第四代,G4),制备的纳米复合材料G4-[Ru(dcbpy)2dppz]2+-DPEA与链霉亲和素标记的检测抗体结合后发生夹心免疫反应,检测方法的线性范围为0.1～1 ng/mL,检测线降至0.028 pg/mL。

总的来说,电化学发光法方法结合了荧光探针法高灵敏度以及电化学法仪器设备体积小、构造简单、价格低廉等优势,在可便携式读数的基础上提供了一种有效的信号放大手段,进一步提高了检测的灵敏性,为进一步的生物分析和临床研究提供了巨大的潜力[58]。

5 拉曼光谱法

拉曼光谱(Raman spectroscopy)是一种产生于分子能级或晶格振动能级的光子非弹性散射光谱,其特征峰具有指纹谱特性,位置、强度和线宽可提供分子振动、转动等信息,据此反映分子中化学键和官能团的构成[59-60]。表面增强拉曼散射(surface enhancement of Raman scattering,SERS)则是在常规拉曼光谱法的基础上,将样品吸附在胶质金属颗粒如银、金或铜表面,或吸附在这些金属片的粗糙表面上后再进行分析,通过这种预处理,可以使样品拉曼光谱的强度提高3～6个数量级。理论上讲,这种灵敏度完全可以用于生物样本中酶的定性和定量分析[61],然而尽管将该技术用于酶等生物大分子的检测分析方法的想法早在20多年前就已经被提出[62-63],但是如何设计能被目标酶高效、快速、有选择性地切割的底物分子,进而释放可被基材捕获并引起SERS反应的报告分子是困扰研究人员的一大难题。Nirala等[64]经过探索,首次设计成功了一种性能优异的底物分子,他们利用多孔硅干涉仪作为SERS平台,并向其中嵌入银纳米颗粒。底物分子吸附到银纳米颗粒上,产生一个指示性的指纹光谱,强度与底物分子浓度成正比。NAG催化裂解底物产成葡萄糖残基和1-萘酚,后者立即与重氮染料发生反应,耦合反应产生的不溶性产物与Ag-PSi SERS平台相互作用,同时放大局部电磁场,使光谱信号发生显著变化[65](图3),对尿液和血浆中NAG活力的检测限分别为0.07 mU/mL和0.50 mU/mL。

图3 NAG活性相关的SERS信号的机理[62]Fig.3 Mechanism of SERS signals related to NAG activity[62]

拉曼光谱法具有无需样品预处理、受浓度干扰小、可同时测定多种组分等优点,任何气态、液态、固态样品均可直接通过探头进行检测并提供无损、快速、简单、可重复的定性定量分析[66],缺点是容易受到固体粒子、气泡或浑浊系统中细胞的光散射的干扰[67]。

6 结论

NAG作为肾脏损伤一种重要生物标志物,其检测技术对于肾脏疾病的诊断治疗具有重要意义。自20世纪80年代以来,研究人员通过结构优化以及技术融合的方式,发展了多种NAG活力测试技术,在科研和临床中发挥了很大作用。对于NAG酶的检测正在向便携小型化发展,并在灵敏度、稳定性和成本效益方面进行优化。但是该领域仍有一些难点尚未攻克,未来的研究重点将主要聚焦于以下几个方面。

(1)提升检测技术的灵敏度,持续优化底物分子结构,以改进结构设计,开发具有不同信号显色底物与酶的新组合。扩展特定底物的选择和更广泛的标记酶,以实现在单一或多种酶的实时监测至关重要。合理运用空间位阻、吸/给电子官能团、重原子效应,充分考虑分子聚集、内滤效应、共振能量转移等因素对输出信号产生的影响,发展包括荧光-比色联用在内的多技术联用检测方法。

(2)拓展检测技术的线性区间,健康样本和患者样本中NAG的活力差值最大可达近2个数量级,现有的检测技术中,有相当一部分线性区间无法达到这样的水平。探索构建多通道底物,以及在同一检测体系中交叉使用多种形式的信号输出模式(如荧光、比色、光声和核磁等信号)。

(3)发展诊疗一体的NAG检测技术,将肾脏疾病控制在早期阶段,提高疾病的治愈率,降低治疗成本,拓展NAG检测技术在临床的应用。