细菌在两种容器的乙醇酸盐流体培养基中生长差异性探讨

李趣嫦，江艳芳，赖珊

广东省药品检验所，广东 广州 510663

硫乙醇酸盐流体培养基为药品无菌检查法中用于培养厌氧菌和需氧菌的培养基。查阅《中华人民共和国药典》（以下简称《中国药典》）2015、2020年版［1-2］及相关文献［3-6］，药品无菌检查一般采用直接接种法和薄膜过滤法两种方法。直接接种法为取规定量供试品接种至装量不少于15 mL 的硫乙醇酸盐流体培养基或胰酪大豆胨液体培养基的试管中进行培养观察。薄膜过滤法则是取规定量供试品，用一次性封闭式薄膜过滤器进行过滤冲洗，滤干后在薄膜过滤器里加入体积为100 mL 硫乙醇酸盐流体培养基或胰酪大豆胨液体培养基进行培养观察。本文研究5 种细菌（金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌和洋葱伯克霍尔德菌）在一次性封闭式薄膜过滤器与试管的硫乙醇酸盐流体培养基中生长是否存在差异，旨在为检测机构和药品生产厂家提供参考，更好地监测和保障无菌检查的科学性和真实性。

1 仪器与材料

1.1 仪器

BRE240 型生化培养箱（法国Froilabo 公司）；Thermo Scientific 1300 Series A2 型生物安全柜（美国赛默飞世尔科技）；Lab dancer 漩涡混合器(德国IKA 艾卡集团）；WJ-6 无菌检查仪（天津罗根科技）；NS01-3 型一次性封闭式薄膜过滤器（北京牛牛科技）。

1.2 菌种

金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）［CMCC（B）26 003］、铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）［CMCC（B）10 104］、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis)［CMCC（B）63 501］、生孢梭菌（Clostridium sporogenes）［CMCC（B）64 941］和洋葱伯克霍尔德菌（Burkholderia cepacia）［CMCC（B）23 005］均购自中国食品药品检定研究院。

1.3 培养基

胰酪大豆胨液体培养基(批号：1086401)、硫乙醇酸盐流体培养基(批号：1091325)、胰酪大豆胨琼脂(批号：2002202)均购自北京三药科技有限公司；哥伦比亚琼脂养基(批号：1082711)购自广东环凯微生物科技有限公司。

1.4 试药

自编号1～8 的硫乙醇酸盐流体培养基生产厂家及批号分别为：1.北京三药科技有限公司，1 091325；2.广东环凯微生物科技有限公司，1 095281；3.北京鸿润宝顺科技有限公司，201110；4.青岛高科技工业园海博生物技术有限公司，20 201107；5.北京奥博星生物技术有限责任公司，20 201208；6.北京陆桥技术股份有限公司，201107；7.Becton，Dickinson and Company，0 048064；8.默克股份两合公司，654833。培养基1～8 均为脱水培养基。

2 方法与结果

2.1 菌液的制备

取金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌和洋葱伯克霍尔德菌的新鲜培养物，按照《中国药典》2020 年版制备成浓度为10～100 cfu/mL 的菌悬液；取上述菌悬液，按十倍稀释法稀释制成1～10 cfu/mL 的菌悬液。

2.2 菌液的计数

取上述制备好的浓度为10～100 cfu/mL 和1～10 cfu/mL 的各菌悬液各1 mL 注入平皿中，其中接种金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌和洋葱伯克霍尔德菌菌悬液的平皿倾注胰酪大豆胨琼脂，置32.5 ℃培养；接种生孢梭菌菌悬液的平皿倾注哥伦比亚琼脂，置32.5 ℃厌氧培养，平行制备2个平皿，测定各菌悬液的菌落数（表1）。

表1 菌液计数结果

2.3 生长情况检查

实验前先测量各厂家培养基的氧化层高度和培养基的总高度，计算二者比值，结果均符合《中国药典》2020 年版的规定（表2）。然后取一次性薄膜过滤器，分别加入8 个厂家的硫乙醇酸盐流体培养基，装量为100 mL、50 mL；另取无菌试管，加入上述培养基，装量为15 mL。各厂家的培养基每个不同的装量各制备21 支，分别接种浓度为10～100 cfu/mL 和1～10 cfu/mL 的金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌和洋葱伯克霍尔德菌的菌悬液，各菌株两个浓度各接种2 管，另取1 管不接种作为空白对照，置32.5 ℃培养3 d，每株菌共4 管均生长良好判为该培养基通过。重复实验3 次，以保证实验的重现性。

表2 氧化层测量结果

2.4 结果

一次性薄膜过滤器装量50 mL 及试管装量15 mL，菌悬液浓度为10～100 cfu/mL 和1～10 cfu/mL 中，5 种细菌在规定时间内均生长良好；一次性薄膜过滤器装量100 mL，菌悬液浓度为10～100 cfu/mL，5 种细菌在规定时间内也均生长良好。而在一次性薄膜过滤器装量100 mL，菌悬液浓度为1～10 cfu/mL的生长检查中，8 批次中有2 批次的铜绿假单胞菌不生长（表3），有3 批次的枯草芽孢杆菌不生长（表4）。

表3 铜绿假单胞菌（1～10 cfu/mL）生长情况结果

表4 枯草芽孢杆菌（1～10 cfu/mL）生长情况结果

3 讨论

在本研究中，硫乙醇酸盐流体培养基生长试验除了使用《中国药典》2020 版中灵敏度检查规定的3 个菌株外，还加入了枯草芽孢杆菌和洋葱伯克霍尔德菌，原因为枯草芽孢杆菌属于芽孢杆菌类细菌，该类细菌在生长环境不利的条件下可转为芽孢，污染药品后很难对其杀灭；而洋葱伯克霍尔德菌为条件致病菌，为最近几年研究热点，易在制药行业中水系统生存，药品生产中易受到其污染［7-10］，故增加这两株菌作为生长检查的挑战菌株。

在本研究结果中，5 种细菌在一次性薄膜过滤器装量为100 mL，菌悬液浓度为1～10 cfu/mL 的生长检查中，8 批次培养基中有2 批次的铜绿假单胞菌不生长，有3 批次的枯草芽孢杆菌不生长，通过率为38%。而在试管装量为15 mL，菌悬液浓度为1～10 cfu/mL 的生长检查通过率为100%。所有厂家的硫乙醇酸盐流体培养基按照药典方法，用试管装量为15 mL 做生长检查试验，菌悬液浓度为10～100 cfu/mL 和1～10 cfu/mL 均能全部通过，说明所有厂家的培养基质量是符合现行药典规定。故结果存在差异主要原因分析为：一次性薄膜过滤器装量为100 mL 与其装量为50 mL 和试管装量为15 mL 的培养基用量和高度不一致，装量为15 mL 的试管和装量为50 mL 过滤器的培养基的容器内部空气含量较大，含氧总量比装量为100 mL 的过滤器多；且装量为15 mL 的试管和装量为50 mL 过滤器的培养基的体积较少，培养基的氧化层更容易受到氧气的影响。而硫乙醇酸盐流体培养基会根据含氧量调节氧化层，从而导致培养系统不一致。这可从装量为100 mL 的一次性薄膜过滤器生长检查不通过的菌株为需氧菌类的枯草芽孢杆菌和铜绿假单胞菌可推断。故在使用硫乙醇酸盐流体培养基时按实际选取恰当的容器考察其生长，必要时增加产品易受污染的菌株或环境分离的菌株考察其生长情况，以降低无菌检查中硫乙醇酸盐流体培养基假阴性出现的概率。