超高效液相色谱串联质谱法测定除臭类化妆品中乌洛托品及13种喹诺酮类抗菌物质

涂晓琴，钟慧，吴姣娇，殷帅，黄海萍，潘小红*（1.湖南省药品检验检测研究院，长沙 410001；2.湖南省药品质量评价工程技术研究中心，长沙 410001）

随着现代社会的发展和人们自我关注的增强，体味的遮盖和消除越来越受到重视，止汗除臭类化妆品作为个人卫生护理品市场的三大产品之一，其全球市场销售额居个人护理品的前列[1-2]。研究表明 ，除臭化妆品达到除臭效果通常有以下两种方式：① 通过强力的收敛作用来抑制汗液的过度排出，间接除臭；② 抑制微生物对汗液的降解减少恶臭物质的产生[3-4]。除臭产品的热销让商家看到了商机，为追求利益、达到良好的除臭效果，不法商家违法在化妆品中添加抗菌药物类抑菌剂，越来越多的化妆品中被检出此类违法添加物[5]。

乌洛托品一般作为防腐剂添加到化妆品中，在弱酸性条件下可分解产生甲醛和氨，起到杀菌作用[6]；喹诺酮类物质具有良好的抗菌性能，能有效抑制微生物分解汗液来减少不良气味。乌洛托品和喹诺酮类物质虽能有效减少臭气产生，但长期使用含此类物质的化妆品存在安全风险，可引起皮肤过敏、皮炎和湿疹，并伴有奇痒和脱皮等症状，同时也会导致对抗菌药物产生耐药性[7-8]。《化妆品安全技术规范》（2015年版）[9]中化妆品准用防腐剂列表删除了乌洛托品，且规定抗菌药物类药物不得作为原料或组分添加到化妆品中。2021年1月1日开始施行的《化妆品监督管理条例》[10]，除臭化妆品不再作为特殊化妆品，而是作为普通化妆品管理，管理的松懈更是让不法商家看到可趁之机，该类化妆品中的非法添加物质风险仍然很高。

《化妆品安全技术规范》（2015年版）[9]仅规定了依诺沙星等10种组分的检测方法，乌洛托品也鲜少有与其他组分同时测定的报道。本文通过优化提取溶剂、流动相等关键因素，采用超高效液相色谱串联三重四极杆质谱（UPLC-MS/MS）检测除臭化妆品中乌洛托品及13种喹诺酮类抗菌药物（依诺沙星、氟罗沙星、诺氟沙星、氧氟沙星、培氟沙星、环丙沙星、洛美沙星、恩诺沙星、沙拉沙星、双氟沙星、司帕沙星、莫西沙星、那氟沙星），并对市场上不同包装剂型的除臭化妆品进行检测，为除臭化妆品的质量安全监测提供技术支撑。

1 仪器与试药

1.1 仪器

LC-30A超高效液相色谱仪（日本岛津公司）；API5500三重四极杆质谱仪，配电喷雾离子源（ESI）（美国AB Science公司）；PM5-2000TD型超声波清洗仪（英国PRIMA公司）；Multifuge X1型高速冷冻离心机（美国Thermofisher公司）。

1.2 试药

氯化钠（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；甲酸、乙腈、甲酸铵（色谱纯，德国Merck公司）；水为一级实验用水。

乌洛托品溶液（批号：2204556，质量浓度：1000 mg·L-1，ANPEL）；双氟沙星盐酸盐（批号：D0017994，纯度：96.6%，BePure）；依诺沙星（批号：130453-201802，纯度：91.5%）、氟罗沙星（批号：130158-200902，纯度：99.2%）、诺氟沙星（批号：130450-201907，纯度：99.6%）、氧氟沙星（批号：130450-201907，纯度：99.5%）、培氟沙星（批号：130459-201402，纯度：71.3%）、环丙沙星（批号：130451-201904，纯度：83.1%）、洛美沙星（批号：130452-201603，纯度：90.4%）、恩诺沙星（批号：510117-201501，纯度：100%）、盐酸沙拉沙星（批号：510118-201501，纯度：100%）、司帕沙星（批号：130461-201502，纯度：99.4%）、莫西沙星（批号：510140-202003，纯度：95.6%）、那氟沙星（批号：130462-201001，纯度：97.0%）（中国食品药品检定研究院）。

样品来源于随机抽取市场和网络销售宣称具除臭作用的化妆品，共126批，采样区域覆盖省会城市、地级市、市县/区县；采样点涉及网购平台、批发市场、商场及小商店。

2 方法与结果

2.1 检测条件

2.1.1 色谱条件 色谱柱：十八烷基键合硅胶质谱柱（100 mm×2.1 mm，3 μm）；柱温：40℃；流动相：A为5 mmol·L-1甲酸铵溶液，B为乙腈；流速：0.3 mL·min-1；进样量：3 μL；梯度洗脱程序设置见表1。

表1 洗脱程序Tab 1 Gradient elution program

2.1.2 质谱条件 MS条件：电喷雾离子源；正离子多离子反应监测模式（ESI+）；喷雾电压：4500 eV；离子源温度：500℃；离子源气体：50 psi；辅助气：25 psi；气帘气：35 psi；离子驻留时间：20 ms；相应的母离子、子离子、碎裂电压（DP）和碰撞电压（CE）等参数见表2。

表2 14种目标化合物质谱检测条件Tab 2 MS parameters of 14 target compounds

2.2 溶液制备

2.2.1 标准溶液配制

① 标准储备溶液：分别称取乌洛托品、依诺沙星、氟罗沙星、诺氟沙星、氧氟沙星、培氟沙星、环丙沙星、洛美沙星、恩诺沙星、沙拉沙星、双氟沙星、司帕沙星、莫西沙星、那氟沙星适量，用乙腈配制成1 g·L-1的各单标标准储备溶液，于4℃条件下保存。

② 混合标准品工作溶液：精密移取上述各单标标准储备液0.1 mL，置10 mL量瓶中，用50%乙腈定容，摇匀，得10 mg·L-1混合标准工作溶液，于4℃条件下保存。

③ 系列标准曲线溶液：分别精密移取混合标准品工作溶液适量，用50%乙腈稀释成10、25、50、75、100、150 ng·mL-1的系列对照品工作液。

2.2.2 供试品溶液的制备 准确称取化妆品样品（实际样品或空白样品）0.2 g（精确到0.0001 g），置于10 mL离心管中，准确加入3 mL饱和氯化钠溶液，涡旋30 s，分散均匀，加入乙腈5 mL，涡旋30 s，超声提取20 min，静置至室温，加水定容至刻度，摇匀，以8000 r·min-1离心5 min，滤过[必要时取上清液适量用50%乙腈稀释至标准曲线浓度范围内，稀释液经0.22 μm滤膜过滤]后进样测定。

2.2.3 样品测定和结果计算 按上述条件测定加标标准溶液和待测溶液，采用特征离子丰度比进行定性，根据表3回归直线方程定量，按式（1）计算样品中目标组分的含量。

式中：ω代表样品中待测组分的质量分数（µg·g-1）；ρ代表从标准曲线得到待测组分的质量浓度（ng·mL-1）；V代表样品定容体积（mL）；m-样品取样量（g）；D-稀释倍数（如未稀释则为1）。

2.3 基质效应

基质效应是指样品中除分析物以外的其他成分对待测物测定值的影响[11]，测定标准样品，尽可能保持样品中基质不变，建立一个校正曲线，用基质标准曲线与溶剂标准曲线的斜率比值进行评估[12-13]。公式如下：

MF＝Ka/Kb

式中，Ka代表基质标准曲线的斜率；Kb代表溶剂标准曲线的斜率；MF代表基质效应，MF＜1表示基质抑制；MF＞1表示基质增强。

2.4 色谱条件的优化

使用十八烷基键合硅胶质谱柱，参考该类物质的常用流动相[9]，水相通常选0.1%甲酸溶液或5 mmol·L-1甲酸铵，有机相选择甲醇和乙腈。试验结果表明，在5 mmol·L-1甲酸铵条件下，目标化合物色谱峰响应更高，依诺沙星的色谱峰峰形更好。有机相为乙腈时，峰形更好、柱压相对更低。综合考虑选0.1%甲酸溶液和乙腈作为流动相，在此条件下，14种目标化合物能有效分离。

2.5 提取条件的优化

参考化妆品样品的常规处理方法[9]，比较下列两种处理方式：① 50%乙腈溶液直接超声提取；② 饱和氯化钠溶液处理后用乙腈提取。试验结果表明，加入饱和氯化钠溶液处理后样品溶液杂峰明显减少。最终确定样品前处理方式：准确称取化妆品样品0.2 g（精确到0.0001 g），置于10 mL离心管中，准确加入3 mL饱和氯化钠溶液，涡旋30 s，再准确加入5 mL乙腈，超声提取30 min，放至室温后，加水定容至刻度，混匀，过滤后作为供试品溶液备用。

2.6 方法性能评估

2.6.1 线性关系与检测限 在确定的最优色谱和质谱条件下，配制一系列不同浓度（6.22～256.80 ng·mL-1）的混合标准溶液进行测定，以各成分的定量离子对峰面积（Y）对质量浓度（X）绘制标准曲线，结果见表3。

2.6.2 基质效应 向水状及粉状阴性基质中分别加入不同体积“2.2.1”项下混合标准品工作溶液，配制成10、25、50、75、100、150 ng·mL-1的系列基质对照品工作液，进样测定，计算基质效应，结果司帕沙星为强基质效应，其余13种目标组分均为强抑制效应[14]。化妆品的水状和粉状基质的存在影响了色谱系统活性位点与待测物分子的作用，使得14种待测成分检测信号增强或减弱，在实际的样品含量测定中，为减轻基质效应的影响，均以基质标准曲线来计算实际含量。

2.6.3 加标回收率与重复性 取阴性的水状样品作为基质进行加标回收测定，精密称取12份于10 mL比色管中（0.2 g/份），分别加入适量混合标准品工作溶液，使其达到10 ng·mL-1（低浓度，3份）、30 ng·mL-1（中浓度，6份）和50 ng·mL-1（高浓度，3份），准确加入3 mL饱和氯化钠溶液，按“2.2.2”项下方法制备，进样测定，计算方法回收率和RSD，结果见表4，空白基质在低、中、高浓度的提取回收率在83.7%～115.7%，RSD均小于5.0%。

以阴性水状基质加标至中浓度（30 ng·mL-1）的6份样品回收率结果计算重复性（见表4），14种目标化合物的回收率在83.7%～108.7%，RSD均低于4.5%。

2.6.4 准确度 为验证方法的准确度，精密称取水状基质和粉状基质阴性样品各3份于10 mL比色管中（0.2 g/份），分别加入适量混合标准品工作溶液，使其达到30 ng·mL-1，准确加入3 mL饱和氯化钠溶液，按“2.2.2”项下供试品溶液的制备方法处理，结果见表5，不同基质提取回收率均在83.0%～115.3%，RSD均小于5.0%。

表5 14种目标化合物的准确度结果Tab 5 Method accuracy of 14 target compounds

2.7 实际样品测定

共采集除臭化妆品126批，包含水状和粉状样品，由于基质效应对结果影响较大，实际样品含量测定中，采用基质标准曲线计算。经检测，1批样品检出乌洛托品1.7 mg·g-1，《化妆品安全技术规范》（2015年版）[9]将乌洛托品从准用防腐剂目录中删除，但并未列入《已使用化妆品原料目录》（2021年版），其安全性有待商榷；喹诺酮类物质为禁用组分，经检测，大部分喹诺酮类物质未检出，极少样品检出目标组分培氟沙星、恩诺沙星，但检出量均低于方法检测限（培氟沙星0.0057 μg·kg-1，恩诺沙星0.0050 μg·kg-1），无法准确定量，且由于检出峰较小，离子丰度比匹配不上，需进一步确证。《化妆品监督管理条例》[10]规定除臭化妆品监管由注册转向备案，本次检测发现该类化妆品仍存在风险物质，建议化妆品监管部门适当增加该类化妆品的监督抽检，保障大众用妆安全。

3 讨论

3.1 分析方法优化

乌洛托品及喹诺酮类物质在除臭类化妆品中检出量较低，对分析方法的灵敏度要求较高。文献报道喹诺酮类物质多采用高效液相色谱-质谱法检测[15-16]；乌洛托品可采用气相色谱法、液相色谱法、高效液相色谱-质谱联用法、气相色谱-质谱联用法等[17]，都为单组分测定。本试验需要同时检测乌洛托品和喹诺酮类物质，综合考虑采用UPLC-MS/MS法。化妆品成分复杂，对目标组分易产生干扰，本试验样品处理过程中，加饱和氯化钠溶液破除基质乳化效应，沉淀部分杂质后，再以提取溶剂提取目标组分，能有效降低干扰，增强目标成分的响应值。在选择流动相时，充分考虑目标组分的理化性质，喹诺酮类物质酸度系数（pKa）在5.5～6.9，在酸性介质中更易电离[18]；乌洛托品作为甲醛缓释剂，酸性条件下易电离[19]，选碱性甲酸铵缓冲盐溶液能有效避免其分解。有机相选择甲醇和乙腈时，目标化合物色谱峰响应值相当，但乙腈为流动相时，柱压相对更低，目标组分的峰形也更好。

3.2 研究结果分析

本研究发现，除臭化妆品中仍存在乌洛托品及个别抗菌成分检出的情况，化妆品安全风险依然存在，UPLC-MS/MS同时测定乌洛托品及13种喹诺酮类抗菌检测方法可提高化妆品检测的工作效率，利于监测化妆品中抗菌物质的含量，对化妆品中抗菌药物的监管和监督具有重要意义。随着社会的发展和科技进步，化妆品中非法添加风险物质种类不断增加，多为目前标准体系外的组分，建议扩展化妆品非法添加物质库，建立统一的检验标准，降低化妆品中的高风险药物成分引发的风险；加强技术能力建设，开发高通量筛查系统，开展非法添加趋势分析等，提高监管系统打击非法添加的能力。