舒筋健腰丸干预TGF-β1/Smad通路抑制大鼠黄韧带纤维化的研究❋

冯 蓬,李路广,李建国,高春雨,高景华△,刘海英

(1.中国中医科学院望京医院,北京 100102;2. 广州白云山陈李济药厂有限公司,广州 510288)

腰椎管狭窄症普遍存在于老年人群,主要症状表现为长期腰痛、腿痛以及间歇性跛行,是脊柱手术的主要原因之一[1]。黄韧带肥厚是导致腰椎管狭窄症的常见病因,组织学上已证实黄韧带肥厚的本质病理改变为纤维化[2]。在解剖层面,黄韧带是脊柱后柱的重要组成部分,具有维持脊柱稳定性和限制脊柱前屈的作用,椎体失稳或过度前屈会造成黄韧带微损伤,继而引发炎症反应和继发纤维化[3]。正常的黄韧带是由弹性蛋白(80%)和胶原蛋白(20%)组成的弹性致密结构[4],而纤维化黄韧带则表现为胶原蛋白增多、堆积,弹性蛋白扭曲、减少和变形,胶原容积分数(collagen volume fraction, CVF)增大,细胞外基质沉积、重塑[5]。黄韧带纤维化是动态变化、逐渐累积的病理过程,具有一定的可塑性[6]。

组织纤维化和炎症反应密切相关[7]。转化生长因子(transforming growth factor, TGF)β1被认为是二者的关键介质,其可以通过激活下游的Smad信号通路介导组织纤维化和激发炎症反应[8-9]。以往研究发现,TGF-β1/Smad通路在韧带、肾、肝、肺、子宫和心脏等诸多器官的纤维化中均发挥着重要作用[8,10-13]。一方面,TGF-β1/Smad通路的激活能够促进纤维化的发生;另一方面,该通路的激活也能够激发炎症反应,引发疼痛刺激。在前期基础研究中,研究团队发现TGF-β1在人和大鼠纤维化黄韧带中显著高表达[14]。

近年来中药的抗纤维化作用逐渐受到关注[15-16]。舒筋健腰丸是自主研制的纯中药复方制剂,具有补益肝肾、强健筋骨、祛风除湿、活络止痛的功效。多组随机对照临床试验表明舒筋健腰丸治疗腰椎管狭窄症(黄韧带肥厚型)具有良好的疗效,同时研究团队成功开展了前瞻性、大样本、多中心的真实世界安全性评价[17]。临床研究表明,舒筋健腰丸可显著缓解腰椎管狭窄症患者的腰痛和间歇性跛行症状,但具体机制仍需进一步研究。因此,本研究从黄韧带TGF-β1/Smad通路方面探讨舒筋健腰丸干预黄韧带纤维化的机制,为舒筋健腰丸的临床应用提供实验依据。本实验方案经中国中医科学院望京医院动物实验伦理委员会批准,编号:BJLongan-L-L-003。

1 材料

1.1 动物

SPF级雄性SD大鼠40只,体质量(200±20)g,购于中国食品药品鉴定研究院(北京大兴),动物许可证号:SCXK(京)2017-0005。所有大鼠均饲养于中国中医科学院中医基础理论研究所动物房,饲养环境保持通风良好,温度20～25 ℃,湿度40%～50%,光照12 h与黑暗12 h交替循环,动物自由摄食、摄水。

1.2 主要试剂和仪器

舒筋健腰丸购自广州白云山陈李济药厂有限公司,国药准字Z44021058,规格120 g/瓶;Masson三色染色液、RNA提取液购自武汉塞维尔生物科技有限公司,货号分别为G1006、G3013;兔抗大鼠Smad2/3、Smad4、Smad7、Ⅰ型胶原蛋白(Collagen Ⅰ)、Ⅲ型胶原蛋白(Collagen Ⅲ)、山羊抗大鼠二抗亦从武汉塞维尔生物科技有限公司购入,货号分别为GB111844、GB11174、GB13542、GB114197、GB111629、GB23302;兔抗大鼠TGF-β1由艾比玛特医药科技(上海)有限公司提供,货号PA2154S。

204型打磨机磨钻,韩国世新精密工业社;RM2235型石蜡切片机,德国徕卡公司;KZ-Ⅲ-F型高速低温组织研磨仪,武汉塞维尔生物科技有限公司;CFX型荧光定量PCR仪,美国伯乐Bio-rad公司;小动物活体能谱CT系统,中国科学院高能物理研究所。

2 方法

2.1 分组与造模方法

适应性饲养1周后,将大鼠分成5组,正常组、模型组、假手术组、舒筋健腰丸低剂量组和高剂量组,每组8只。模型组、低剂量组和高剂量组均采用研究团队前期建立的失稳法黄韧带纤维化大鼠模型。造模方法为:完全切除大鼠L5和L6棘突,磨削双侧L5～L6小关节,切除整个L5～L6椎旁肌,直至椎板暴露,术后3 d注射头孢呋辛钠给予抗感染处理,8周后全部处死用于模型评价和进一步实验。假手术组大鼠予假手术处理。模型评价方法:黄韧带CVF大于30%为成模标准,能谱Micro-CT作为辅助评价标准。

2.2 给药方法

实验所用舒筋健腰丸为浓缩水蜜丸。根据厂家提供的舒筋健腰丸质控标准,所有丸剂分批次每日晨时经过4 ℃、24 h蒸馏水密封浸泡,后经充分搅拌,制成含药浓度为0.05 g/mL的混悬液,随后装于药用高密度聚乙烯密封瓶中并做好标记。为保证混悬液稳定性,所有药液均提前24 h配置并只用于第2天大鼠灌胃。按照人与大鼠体表面积换算公式计算舒筋健腰丸的大鼠给药剂量,低剂量组以1.5 mL/100 g体积灌胃,高剂量组以3 mL/100 g体积灌胃,分别相当于60 kg成人临床用药量的0.5倍和1倍。造模3 d后即开始按计划给药(预防性给药策略)。每日晨时经专人灌胃给药,大鼠每周按照体质量调整给药剂量。正常组、模型组、假手术组大鼠灌胃等体积0.9%氯化钠溶液,每日1次,持续8周。

2.3 处死与取材

在大鼠麻醉状态下,首先利用能谱Micro-CT(高组织分辨率45 μm)扫描大鼠腰椎黄韧带。获取影像学资料后,过量麻醉处死大鼠,取随机一侧大鼠L5～L6腰椎节段黄韧带置于匀浆管中,用于后续荧光定量PCR实验,取另一侧大鼠L5～L6对应黄韧带腰椎节段制作病理组织切片,用于后续免疫组化实验。

2.4 荧光定量PCR

取出放置各组大鼠黄韧带组织的匀浆管,Trizol法提取RNA,反转录为互补的cDNA,配置称20 μL反应体系进行扩增,2-△△Ct法计算目的基因相对表达量。引物信息见表1。

2.5 免疫组化染色

依据课题组前期实验方法,将剩余的大鼠 L5～L6腰椎组织固定、脱钙、切开、脱水、包埋和切片,切片厚度为4 μm[14]。采用免疫组化法检测各组大鼠黄韧带TGF-β1、Smad2/3、Smad4、Smad7、Collagen Ⅰ和Collagen Ⅲ蛋白的表达和定位。一抗稀释倍数均为1:1 000,二抗稀释倍数为1:200。采用专业图像分析系统 Image J 1.50进行分析,以平均光密度值(mean optical density,MOD)作为阳性表达强度的评价参数。在200倍镜视野下,每张切片随机拍摄 3个视野,取平均值作为每张切片的观察结果。

2.6 统计学方法

3 结果

3.1 各组大鼠黄韧带纤维化评估结果

图1示,与造模前比较,能谱Micro-CT影像显示造模后对应层面黄韧带区域椎板间可见软组织填充增多并伴随不规则、混杂信号影,硬膜囊未见明显受压。与正常组比较,模型组大鼠黄韧带胶原纤维显著增多,“弹性-胶原”纤维比值明显降低,CVF显著升高(P<0.05),弹性纤维扭曲、堆积;与模型组比较,高剂量组大鼠黄韧带胶原纤维含量明显降低,胶原纤维扭曲、堆积、断裂现象明显减少,CVF显著下降(P<0.05),但CVF数值仍高于20%;模型组与低剂量组比较CVF差异无统计学意义。

注:A～B分别为活体能谱Micro-CT造模前和造模后的典型CT影像图片(L5～L6层面),比例尺=3000 μm,红色虚框代表增生的黄韧带区域;C～G分别为正常组、假手术组、模型组、低剂量组和高剂量组大鼠腰椎L5～L6层面黄韧带Masson染色,比例尺=20 μm;H.各组大鼠腰椎L5～L6黄韧带Masson染色CVF结果统计分析;与正常组比较*P<0.05;与模型组比较∇P<0.05

3.2 各组大鼠免疫组化染色结果

图2A示,各组染色图片中TGF-β1、Collagen Ⅰ和Collagen Ⅲ阳性染色均位于细胞外基质,呈弥散样定位;Smad2/3、Smad4和Smad7的定位相对集中,主要定位在细胞质中。图2B示,统计分析结果表明,与正常组比较,模型组大鼠黄韧带组织中TGF-β1、Smad2/3、Smad4、Collagen Ⅰ和Collagen Ⅲ表达明显增加(P<0.05),Smad7表达明显降低(P<0.05);与模型组比较,高剂量组大鼠黄韧带组织中TGF-β1、Smad2/3、Smad4、Collagen Ⅰ和Collagen Ⅲ表达显著降低(P<0.05),Smad7表达明显增加(P<0.05);低剂量组与模型组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。

注:转化生长因子β1(TGF-β1),Ⅰ型胶原蛋白(Collagen Ⅰ),Ⅲ型胶原蛋白(Collagen Ⅲ);与正常组比较*P<0.05;与模型组比较∇P<0.05;A．各组大鼠黄韧带中TGF-β1/Smad通路相关蛋白以及Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ免疫组化染色图(×200);B.黄韧带免疫组化结果统计分析柱状图(每张切片随机选取3个视野,n=8,)

3.3 各组大鼠荧光定量PCR检测结果

表2显示,与正常组比较,模型组大鼠黄韧带组织中TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad4 mRNA表达显著增加(P<0.01),Smad7 mRNA表达显著降低(P<0.01);与模型组比较,高剂量组大鼠黄韧带组织中TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad4 mRNA表达显著降低(P<0.01),Smad7 mRNA表达显著增加(P<0.01);低剂量组与模型组比较,差异无统计学意义。

表2 各组大鼠黄韧带中TGF-β1/Smad通路相关mRNA表达比较

4 讨论

中医典籍中并没有关于腰椎管狭窄症和黄韧带肥厚的论述,但根据发病机制和临床表现可将其归为“腰痛病”“痹证”和“腰腿痛”的范畴。黄韧带肥厚的患者更多见于老年人,若以脏腑论治,该疾病应以肝肾亏虚为本,风、寒、湿邪侵袭为标,痰湿、瘀血为主要病理产物。因此,治疗本病应当在祛风、除湿、散寒的基础上,对肝肾加以固护,补泻兼施,以通为用,扶正以祛邪,最终达到化湿、行瘀的功效。舒筋健腰丸由狗脊、金樱子、鸡血藤、千斤拔、黑老虎、牛大力、女贞子(蒸)、桑寄生(蒸)、菟丝子(盐制)、延胡索(制)、两面针、乳香(制)、没药(制)组成。从方药组成来看,该方标本兼治、配伍严谨,具补益肝肾、行气化瘀、祛风散寒之功。正如《证治汇补》中记载“治惟补肾为先……标急则治标,本急则治本,初痛宜疏邪滞,理经髓,久痛宜补真气,养血气”。课题组前期研究表明,舒筋健腰丸能够有效缓解腰痛,并且能够显著抑制血清中的炎症因子表达[18-19]。然而,该方对炎症反应和纤维化的具体作用机制尚不清楚。因此,研究团队选用大鼠黄韧带纤维化模型,旨在观察舒筋健腰丸对黄韧带纤维化进展的抑制作用,并探讨该药对TGF-β1/Smad通路的调控作用。

从本研究中Masson染色和免疫组化结果可以看出,高剂量舒筋健腰丸可以显著抑制大鼠黄韧带中Ⅰ和Ⅲ型胶原蛋白的表达,显著增加黄韧带CVF,抑制了细胞外基质的无序堆积,对持续微损伤的黄韧带具有一定的保护作用。TGF-β1/Smad通路在纤维化过程中具有重要作用,该通路的激活与下游Smad蛋白家族有关。其中Smad2、Smad3和Smad4可形成转录因子复合体而核转位,促进TGF-β1产生,而Smad7属于抑制型Smad,能够通过阻止上述转录因子复合体核转位等多种途径抑制TGF-β1分泌[20]。本研究结果显示高剂量舒筋健腰丸能够显著抑制大鼠黄韧带中TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad4蛋白和mRNA表达,增加smad7蛋白和mRNA表达,发挥对黄韧带中TGF-β1/Smad通路的抑制作用。同时,本次实验结果还发现舒筋健腰丸的作用具有剂量依赖性,低剂量可能不具备减少黄韧带病理产物堆积与抑制TGF-β1/Smad通路活性的能力;而高剂量舒筋健腰丸仍不能将黄韧带CVF和TGF-β1/Smad通路相关指标的表达水平恢复至正常,这表明舒筋健腰丸可能无法阻止或者逆转黄韧带纤维化进程。

综上所述,使用人等效剂量的舒筋健腰丸能够显著抑制模型大鼠的黄韧带纤维化进展,抑制大鼠纤维化黄韧带病理产物的堆积,显著抑制大鼠黄韧带中TGF-β1/Smad通路关键蛋白的表达。本研究为临床应用舒筋健腰丸干预黄韧带肥厚型腰椎管狭窄症提供了实验依据。