辽东楤木皂苷含量测定方法的研究

2023-11-02周禹辰

化工时刊 2023年4期

周禹辰潘飞赵昕徐威

(1. 沈阳工业大学机械工程学院,辽宁沈阳 110870;2. 辽宁省复杂曲面数控制造技术重点实验室,辽宁沈阳 110870)

辽东楤木又称刺嫩芽、虎阳刺等,广泛分布于我国东北地区,其不仅可以观赏,在药用方面也有极其显著的作用[1]。经实验研究发现,辽东楤木在抗衰老、抗氧化、抗炎、抗癌及保肝等方面都有着显著作用[2]。

辽东楤木中包含着非常多的活性物质,其中皂苷类化合物作为辽东楤木的主要活性成分,其营养价值更为显著。但由于皂苷类物质种类复杂多样,还没有专门针对辽东楤木总皂苷含量测定的国标方法。皂苷是由苷元以及糖链相连接而成的化合物,辽东楤木中皂苷类成分的苷元多为齐墩果酸,可将水解后齐墩果酸的含量作为辽东楤木中总皂苷的含量。以齐墩果酸标准品作为对照制作标准曲线,通过标准曲线计算出辽东楤木中皂苷的含量。

本文对硫酸-甲醇比色法、香草醛-浓硫酸比色法和香草醛-高氯酸比色法进行对比分析研究,为辽东楤木总皂苷含量测定方法提供一定的参考。

1 实验

1.1 试剂及仪器

主要试剂:香草醛,冰醋酸,浓硫酸,高氯酸,无水乙醇,甲醇, 试剂均购自沈阳化学试剂厂;齐墩果酸标准品(110709—200304),中国药品生物鉴定所生产。

主要仪器:EST500-2电子天平,沈阳天平仪器有限公司;DHG-9070A电热恒温鼓风干燥箱,上海精宏实验设备有限公司;LG0.2真空冷冻干燥机,沈阳新阳航空设备制造有限公司;WH-A150高速多功能粉碎机,南京好又多电器有限公司;UV-5100紫外分光光度计,上海谱元仪器有限公司;RE-52AA旋转蒸发仪,上海亚荣生化仪器厂。

1.2 辽东楤木总皂苷的提取

选用辽东楤木嫩芽为原料,挑选外观完整、没有霉点、没有破损的辽东楤木嫩芽,清洗后于60 ℃下进行热风干燥处理。

取60 ℃热风干燥处理的辽东楤木嫩芽干粉20 g,加入95%的乙醇溶液,固液比1∶15 g·mL-1,在70 ℃下浸提1 h,提取结束后抽滤,收集滤液,再将滤渣溶于相应浓度的乙醇提取液中提取,重复2次上述操作,收集滤液。5 000 r·min-1离心5 min。滤液经旋转蒸发后于-80 ℃条件下预冻后冷冻干燥,将干燥的总皂苷粉末称重,并置于密封袋中避光保存。

取适量干燥的总皂苷粉末,用甲醇配置成0.2 mg·mL-1的样品溶液。

1.3 最大吸收波长的确定

1.3.1 硫酸-甲醇比色法

吸取1 mL 0.2 mg·mL-1样品溶液于带塞比色管中,加入2 mL浓硫酸,混匀,60 ℃水浴30 min,随后立即冰浴,向比色管中加入甲醇至10 mL,充分混匀作为样品溶液,于200 nm～400 nm处进行全波长扫描。

齐墩果酸标准品操作同样品操作,通过对比样品和标准品的最大吸收峰来确定测定波长,在最大吸收波长处测量吸光度,以吸光度对浓度做标准曲线。

1.3.2 香草醛-浓硫酸比色法

吸取1 mL 0.2 mg·mL-1样品溶液于带塞比色管中,水浴蒸干其溶剂,加入0.2 mL的5%香草醛-乙醇溶液,5.8 mL的72%硫酸,混匀,60 ℃水浴15 min,随后立即冰浴,于400～900 nm处进行全波长扫描。

齐墩果酸标准品操作同样品操作,通过对比样品和标准品的最大吸收峰来确定测定波长,在最大吸收波长处测量吸光度,以吸光度对浓度做标准曲线。

1.3.3 香草醛-高氯酸比色法

吸取1 mL 0.2 mg·mL-1样品溶液于带塞比色管中,水浴蒸干其溶剂,向残渣中加入0.2 mL 5%的香草醛-冰醋酸溶液,再加入0.8 mL高氯酸,混合均匀,60 ℃水浴15 min, 随后立即冰浴,再向比色管中加入冰醋酸5 mL,混匀,静置20 min,在400～900 nm处进行全波长扫描。

齐墩果酸标准品操作同样品操作,通过对比样品和标准品的最大吸收峰来确定测定波长,在最大吸收波长处测量吸光度,以吸光度对浓度做标准曲线。

1.4 方法性能的比较

相对标准偏差(RSD)通常用来表示分析实验结果的准确程度,RSD值越小,实验的准确度就越好。通过测定每种方法的精密度、重复性、稳定性的RSD值以及三种方法的平均回收率,以探究不同测定方法的准确程度。

1.4.1 精密度的测定

取1 mL 0.2 mg·mL-1齐墩果酸标准溶液,采用硫酸-甲醇比色法、香草醛-浓硫酸比色法和香草醛-高氯酸比色法三种方法,每种方法测定5次吸光度值并计算平均值和RSD值。

1.4.2 重复性的测定

取同一批次的辽东楤木皂苷5份,分别按照上述三种比色法测定每份样品的皂苷含量,并计算平均值和RSD值。

1.4.3 稳定性的测定

分别在硫酸-甲醇比色法、香草醛-浓硫酸比色法及香草醛-高氯酸比色法处理后得到的显色溶液中取2 mL,每间隔10 min测定一次溶液的吸光度,测定其在60 min内的稳定性。

1.4.4 加标回收率的测定

准确吸取0.2 mg·mL-1辽东楤木皂苷样品溶液1 mL,加入0.2 mg·mL-1的标准品溶液0.1 mL,分别采用硫酸-甲醇比色法、香草醛-浓硫酸比色法和香草醛-高氯酸比色法三种方法,在各自的检测波长下测定吸光度,通过各自标准曲线计算总皂苷的含量,进行5次平行测定,计算平均回收率。

2 结果与分析

2.1 最大吸收波长的确定

分布均匀且平滑的最大吸收波峰可以作为吸收波长用于测定总皂苷含量[4], 实验结果表明,不同比色法具有不同的最大吸收波长。图1、2为硫酸-甲醇比色法样品与标准品的波长扫描图,由图可知,辽东楤木皂苷样品与齐墩果酸标准品在291 nm处均有最大吸收峰,因此该方法选择291 nm作为测定波长。

图2 硫酸-甲醇比色法齐墩果酸波长扫描图Fig. 2 Scanning spectrum of oleanolic acid in methanol-sulfuric acid colorimetry method

图3、4为香草醛-浓硫酸比色法标准品与样品的波长扫描图,由图可知,二者峰型略有不同,但大体相似,且最大吸收波长均为540 nm,因此该方法选择540 nm作为测定波长。

图3 香草醛-浓硫酸比色法辽东楤木总皂苷波长扫描图Fig. 3 Scanning spectrum of Aralia elata in vanillin-concentrated sulfuric acid colorimetry method

图4 香草醛-浓硫酸比色法齐墩果酸波长扫描图Fig. 4 Scanning spectrum of oleanolic acid in vanillin-concentrated sulfuric acid colorimetry method

图5、6为香草醛-高氯酸比色法标准品与样品的波长扫描图,由图可知,辽东楤木皂苷样品最大吸收波长与齐墩果酸标准品一致,均为550 nm,因此该方法选择550 nm作为测定波长。

图5 香草醛-高氯酸比色法辽东楤木总皂苷波长扫描图Fig. 5 Scanning spectrum of Aralia elata in vanillin-perchloric acid colorimetry method

图6 香草醛-高氯酸比色法齐墩果酸波长扫描图Fig. 6 Scanning spectrum of oleanolic acid in vanillin-perchloric acid colorimetry method

2.2 标准曲线的建立

硫酸-甲醇比色法回归方程为y=0.018 5x+0.053 2,相关系数R2为0.998 0,浓度在2～18 μg·mL-1时存在良好的线性关系。香草醛-浓硫酸比色法回归方程为y=0.016 4x+0.164 3,相关系数R2为0.998 7,浓度在2～18 μg·mL-1时存在良好的线性关系;香草醛-高氯酸比色法回归方程为y=0.033 2x+0.002 9,相关系数R2为0.997 9,试验浓度在2～18 μg·mL-1时存在良好的线性关系。

2.3 三种比色法的方法性能测定

表1为三种比色法精密度比较,表2为三种比色法重复性比较,表3为三种比色法稳定性比较,表4为三种比色法平均回收率比较,通过表1、表2、表3、表4分析上述三种方法的性能可以发现,3种比色法中,香草醛-高氯酸比色法重复性较差,而硫酸-甲醇比色法的精密度、重复性及稳定性相对较好,且平均回收率达到了99.7%,测量出的数据相对准确,分析原因可能因为该显色反应是香草醛的醛基与皂苷苷元上的羟基反应,形成新的共轭体系从而发生显色反应,但皂苷苷元连接的糖可能存在未被完全水解,或水解下来的糖可能影响体系的反应,因此香草醛-高氯酸比色法和香草醛-浓硫酸比色法均缺乏稳定性。