大狼毒不同部位浸提液对多年生黑麦草幼苗生长的化感效应及生理机制

罗 钦,马祖艳,牛琼梅,桂宝林,谢 勇,刘 洋,刘 佳,单贵莲*,初晓辉*

(1.云南农业大学草业科学系,云南 昆明 650201;2.寻甸县农业农村局土壤肥料工作站,云南 寻甸 655200;3.云南省昆明市动物疫病预防控制中心,云南 昆明 650223;4.云南省林业与草原局,云南 昆明 650224;5.香格里拉市林业和草原局,云南 迪庆 674499)

滇西北山地草甸是云南天然草地重要组成部分之一,其在当地畜牧业发展及生态屏障方面发挥着巨大的作用[1-2]。然而,由于气候寒冷及过度放牧等自然和人为因素干扰,导致滇西北高寒草甸出现了以大狼毒(Euphorbiajolkinii)、网脉橐吾(Ligulariadictyoneura)等毒害草扩散蔓延为主要特征的草地退化问题[3-5]。

大狼毒属大戟科多年生草本植物,该物种根系发达抗逆性强,分枝能力强,对高寒气候条件有极强的适应性,加之全株有毒家畜拒食,因此目前已成为滇西北退化高寒草甸广泛分布的本土入侵植物[6]及退化指示植物[4]。大狼毒的入侵扩散会引起滇西北高寒草甸物种多样性的显著下降,优质牧草数量锐减[3-4]。王紫媛等[7]研究发现,大狼毒的化感抑它作用是造成滇西北高寒草甸物种多样性下降的原因之一。

毒害草化感抑它作用是改变草地生态系统物种分布格局及驱动群落演替的重要原因[8-14]。刘冠志等[8-10],研究表明,狼毒(Stellerachamaejasme)不同部位水浸液会对紫花苜蓿(Medicagosativa)、披碱草(Elymusdahuricus)、冰草(Agropyronmongolicum)、山韭(Alliumsenescens)等伴生植物产生化感抑制作用,主要表现在影响其种子的发芽和幼苗的生长上。狼毒对伴生植物的化感毒性,可能是草地群落结构变化及植被退化的原因之一[11]。王辉等[12]研究发现,舟叶橐吾(Ligulariacymbulifera)水浸液会抑制白三叶(Trifoliumrepens)、多年生黑麦草(Loliumperenne)、鸭茅(Dactylisglomerata)的种子萌发和幼苗生长。郑亚萍等[13-14]研究表明,外来入侵杂草薇甘菊(Mikaniamicrantha)释放的绿原酸、β-石竹烯等化感物质会影响土壤中氮循环功能菌的繁殖,促进有效氮的生成,进而实现化感利己作用。

综上,化感抑它作用作为毒害草入侵的重要“武器”,是造成草地群落演替及物种多样性降低、数量减少的重要原因。然而,就滇西北高寒草甸普遍分布的有毒植物大狼毒而言,其对优良禾本科牧草种子萌发及幼苗生长的化感效应究竟有多强?检索资料发现前人以紫花苜蓿、早熟禾(Poaannua)等为受体材料,从种子萌发和幼苗形态方面开展了大狼毒对优良牧草化感效应的初步研究,表明化感抑它作用是大狼毒入侵草地物种多样性下降的原因之一[7,15],但大狼毒浸提液化感胁迫会引起优良牧草幼苗发生怎样的生理变化、检索资料发现前人尚未开展过系统研究。据此,本研究以滇西北退化高寒草甸补播治理中常用的‘麦迪’多年生黑麦草(L.perenne‘Mathilde’)为受体材料,开展大狼毒不同部位水浸提液对其种子萌发、幼苗生长、生理及内源激素含量影响的系统研究,通过研究探讨大狼毒对优良牧草的化感效应及生理机制,研究成果对揭示大狼毒的入侵扩散机制具有重要的意义。

1 材料与方法

1.1 供试材料和受试材料

供试材料为采自滇西北高寒草甸的、生长高度长超过50 cm的大狼毒成熟植株。2021年9月,挖取大狼毒植株,洗净根部泥土,将根、茎叶分开,自然风干后粉碎、过筛(孔径0.45 mm),装袋密封备用。

受试材料为购自北京正道公司的‘麦迪’多年生黑麦草,该品种对滇西北高寒气候极为适应,近年来被广泛用于滇西北退化高寒草甸的补播治理。

1.2 研究方法

1.2.1浸提液的制备 以风干的大狼毒根、茎叶粉碎物为材料,采用蒸馏水浸提法制备大狼毒浸提液。分别称取大狼毒根、茎叶120 g,放入1 000 mL蒸馏水中,恒温震荡12 h后静置12 h,用定量滤纸和孔径为0.45 μm的滤膜进行二重过滤,得到120 g·L-1的浸提液母液,用蒸馏水稀释母液,以获得质量浓度为10,20,30,40 g·L-1的浸提液用于种子萌发,以及质量浓度为40,80,120 g·L-1的浸提液用于幼苗生长。浸提液放入4℃的冰箱中冷藏备用[15]。

1.2.2种子发芽试验及指标测定 采用培养皿滤纸法进行种子发芽试验[9]。将受试种子置于2%的次氯酸钠溶液消毒20 min,用蒸馏水冲洗洗净,然后用滤纸吸干种子表面水分。挑选100粒饱满、无病虫害的受试种子置于垫有双层滤纸的培养皿(Φ=9 cm)中,分别加入质量浓度为10,20,30,40 g·L-1浸提液5 mL浸润滤纸(对照组用等量蒸馏水浸润,每处理设3次重复),置于(25±1)℃,14 h光照/10 h黑暗,光强6 000 lx的培养箱中进行培养,每天补充1 mL对应浓度溶液以保持滤纸湿润。定时观察发芽情况,从种子萌发开始统计每天发芽种子的数量,持续统计至经过3 d再无种子发芽结束种子萌发试验,采用郭英姿[16]的方法计算种子发芽率、发芽势和发芽指数。

发芽率(%)=(12 d后长成正常幼苗数量/供试种子数量)×100

发芽势(%)=(5 d后发芽种子总数/供试种子数量)×100

发芽指数(Germination index,GI)=∑(Gt/Dt)

式中：Gt为第t日内的发芽数;Dt是相应的发芽天数;GI为发芽指数。

1.2.3幼苗生长试验及指标测定 幼苗生长试验采用穴盘法进行[15]。采用单孔体积为150 mL的六孔穴盘,于穴盘内加入珍珠岩∶蛭石=1∶1的混合基质,每孔分别播种15粒多年生黑麦草种子(一个穴盘为一个重复,每处理设3次重复),放在(25±1)℃下,14 h光照/10 h黑暗,光强6 000 lx的培养箱进行培养,每隔一天浇一次1/2 Hoagland营养液。出苗后培养30 d左右,待多年生黑麦草生长到分蘖期,分别用浓度为40,80,120 g·L-1的大狼毒根、茎叶浸提液30 mL浇施多年生黑麦草幼苗,对照浇施等量蒸馏水(每3 d浇一次浸提液,3 d浇一次营养液,浇浸提液与营养液时间不在同一天)。持续浇施20 d至多年生黑麦草进入拔节期,其植株地上部分长势出现明显差异时,测定植株的单株鲜重、株高(垂直高度)和根长。参照王学奎等[17]的方法,采用硫代巴比妥酸法测定丙二醛(Malondialdehyde,MDA)含量、NBT光还原法测定超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)活性、紫外吸收法测定过氧化氢酶(Catalase,CAT)活性。参照焦奎等[18]的方法,利用酶联免疫法测定赤霉素(Gibberellic acid,GA)、脱落酸(Abscisic acid,ABA)、吲哚乙酸(Indoleacetic acid,IAA)、玉米素(Zeatin,ZT)、茉莉酸(Jasmonic acid,JA)、水杨酸(Salicylic acid,SA)含量。

1.3 数据处理

采用Excel 2019进行数据统计,采用SPSS 26.0进行one-way ANOVA方差分析及Duncan多重比较。参照Muhammas等[19]的方法计算化感效应指数(Allelopathic response index,RI)和综合化感效应(Synthetical effect of allelopathy,SE),计算公式如下：

RI=1-C/T (T≥C)或RI=T/C-1 (T

SE萌发=(RI发芽率+RI发芽指数)/2

SE幼苗=(RI株高+RI根长+RI单株干重)/3

式中：C为对照组,T为处理组。RI和SE反映化感效应的强弱,<0表现抑制效应,>0表现促进效应,绝对值大小表示作用强度[19]。

2 结果与分析

2.1 大狼毒浸提液对多年生黑麦草种子萌发的影响

大狼毒浸提液处理降低了多年生黑麦草种子的发芽率和发芽指数,呈现随浸提液浓度升高而显著降低的变化趋势(10 g·L-1根浸提液处理下发芽率和发芽指数测定结果除外)(P<0.05)(图1)。具体为：与CK相比,10,20,30,40 g·L-1根浸提液处理下,多年生黑麦草种子发芽率分别降低了6.5%,30.6%,46.5%和78.0%,发芽指数分别降低了5.2%,37.9%,62.0%和85.3%;10,20,30,40 g·L-1茎叶浸提液处理下,多年生黑麦草种子发芽率分别降低了10.6%,20.82%,45.3%和60.4%,发芽指数分别降低了17.9%,30.0%,54.3%和71.4%。

图1 大狼毒浸提液对多年生黑麦草种子萌发的影响Fig.1 Effects of the extracts of E. jolkinii on seed germination of perennial ryegrass注：不同小写字母表示同一部位不同处理间在0.05水平下差异显著。下同Note：Different lowercase letters indicate significant differences between treatments at the 0.05 level.The same as below

由图2可知,大狼毒浸提液对多年生黑麦草种子萌发的综合化感效应指数(SE)均为负值,即大狼毒浸提液对多年生黑麦草种子萌发产生抑制作用,抑制强度随浓度升高而增大。在10 g·L-1浓度下,茎叶浸提液抑制强度大于根浸提液处理,在20～40 g·L-1浓度下,根浸提液抑制强度大于茎叶浸提液处理。

图2 大狼毒浸提液对多年生黑麦草种子萌发综合化感效应Fig.2 Comprehensive allelopathy effect of E. jolkinii extracts on seed germination of perennial ryegrass

2.2 大狼毒浸提液对多年生黑麦草幼苗生长的影响

大狼毒根、茎叶浸提液处理显著降低了多年生黑麦草幼苗的株高、根长和单株干重(40 g·L-1根、茎叶浸提液处理干重测定结果除外)(P<0.05),且降低程度随浸提液浓度的升高而增加(图3)。具体为：与CK相比,40,80,120 g·L-1根浸提液处理下,多年生黑麦草幼苗株高分别降低了6.60,11.99,16.63 cm,根长分别降低了3.16,3.68,4.00 cm,单株干重分别减少了0.01,0.05,0.09 g;40,80,120 g·L-1茎叶浸提液处理下,多年生黑麦草幼苗株高分别降低了7.38,12.56,16.48 cm,根长分别降低了3.55,3.87,5.78 cm,单株干重分别减少了0.01,0.06,0.06 g。

由图4所示,大狼毒根、茎叶浸提液对多年生黑麦草幼苗生长的综合化感效应指数<0,表明其对多年生黑麦草幼苗生长产生抑制作用,抑制强度随浸提液浓度增加而增强,不同部位综合化感效应强度以根>茎叶。

图3 大狼毒浸提液对多年生黑麦草幼苗生长的影响Fig.3 Effect of the extracts of E. jolkinii on the growth of perennial ryegrass seedlings

图4 大狼毒浸提液对多年生黑麦草幼苗生长的综合化感效应Fig.4 Comprehensive allelopathy effect of E. jolkinii extracts on growth of perennial ryegrass seedlings

2.3 大狼毒浸提液对多年生黑麦草幼苗生理的影响

2.3.1对丙二醛含量和抗氧化酶活性的影响 由图5(A)可知,随着大狼毒浸提液浓度的增加,多年生黑麦草幼苗MDA含量显著增加(P<0.05),浸提液浓度为120 g·L-1时MDA含量达最大值。与CK相比,120 g·L-1根、茎叶浸提液处理分别使多年生黑麦草幼苗MDA含量增加了237.6%和196.5%。

由图5(B,C)可知,大狼毒根、茎叶浸提液化感胁迫使多年生黑麦草幼苗体内SOD和CAT活性增加,增加幅度随浸提液浓度增加而增加。当浸提液浓度增加至120 g·L-1时,黑麦草幼苗体内SOD和CAT活性增加至最大值与CK相比差异显著(P<0.05)。与CK相比,120 g·L-1根、茎叶浸提液处理分别使多年生黑麦草幼苗SOD活性提高了24.6%和15.3%,CAT活性提高了43.0%和26.9%。

2.3.2对内源激素含量的影响 由图7可知,大狼毒根、茎叶浸提液处理使多年生黑麦草幼苗体内GA,IAA,ZT,JA,SA含量呈显著下降的变化趋势,下降幅度随浸提液浓度的升高而显著增加(40 g·L-1茎叶浸提液处理下IAA含量测定结果除外)(P<0.05),ABA含量呈上升、下降、再上升的变化趋势,各处理ABA含量均显著大于CK(P<0.05)。与CK相比,120 g·L-1浓度处理下,根浸提液处理分别使多年生黑麦草幼苗体内GA,IAA,ZT,JA,SA含量下降了43.4%,33.6%,38.4%,52.2%,41.2%,茎叶浸提液处理分别使多年生黑麦草幼苗GA,IAA,ZT,JA,SA含量下降了25.5%,25.3%,24.5%,41.6%,16.0%;根、茎叶浸提液处理分别使多年生黑麦草幼苗ABA含量增加了116.7%,110.1%。

3 讨论

植物化感作用是植物与环境长期适应的结果,植物产生的次生代谢物可有效提高植物生存竞争的能力[20]。自然状态下,植物的化感物质通过自然途径进入到环境影响周围植物的生长,化感物质会伴随植物整个生长发育周期[21]。植物间的化感作用主要体现在对受试植物种子萌发和幼苗生长以及生理的影响,而且这种影响与化感作用的强度与水浸液浓度、化感物质种类及受试植物种类相关[7-9,15,22-23]。

种子萌发和幼苗生长是植物生命史重要的两个阶段,其萌发、生长过程易受到外界环境变化的影响。本研究结果表明,在种子萌发阶段,大狼毒根、茎叶浸提液处理抑制了多年生黑麦草种子的萌发,浸提液浓度超过20 g·L-1时,多年生黑麦草种子发芽率和发芽指数显著降低(P<0.05);在幼苗生长阶段,大狼毒根、茎叶浸提液处理抑制了多年生黑麦草幼苗的生长,浸提液浓度超过80 g·L-1时,多年生黑麦草株高、根长、单株干重显著降低(P<0.05)。这一研究结果与王紫媛等[7]、李彦飞等[15]研究得出大狼毒浸提液对受体植物种子和幼苗生长有抑制作用的结果基本一致。

在逆境胁迫下,植物细胞膜系统受氧自由基毒害发生膜脂过氧化作用,其产物MDA含量反映膜脂过氧化程度和膜系统受损程度[24]。SOD和CAT抗氧化酶是植物活性氧(Reactive oxygen species,ROS)清除系统的关键抗氧化酶,用以清除活性氧引起膜脂过氧化对细胞造成的伤害,其活性高低也可反映植物受伤害程度[16,24]。本研究结果显示,大狼毒浸提液处理使多年生黑麦草幼苗MDA含量显著提高(P<0.05),表明多年生黑麦草幼苗在大狼毒浸提液化感胁迫下发生膜脂过氧化作用并生成了有害物质,导致植物体内MDA含量升高,加剧细胞膜损伤,影响植物幼苗的生长[16]。大狼毒浸提液处理下多年生黑麦草幼苗的SOD,CAT含量增加,表明多年生黑麦草幼苗为减轻化感胁迫的负面影响,通过增强SOD和CAT活性以抵抗胁迫损伤,增强抗性。

内源激素是植物体自身代谢产生的微量活性物质,植物通过调控内源激素的合成与代谢应对多种生物、非生物胁迫[25-26]。常见植物激素GA可促进植物发芽、开花、结果及果实发育,IAA可促进植物细胞生长,ZT具有促进叶绿素的生物合成,防止叶片老化的作用,SA能诱导植物对外界胁迫产生抗性,JA可诱导侧根的生长,ABA会启动植物体内一些保护反应,从而使植物对外界胁迫具备一定的适应性[18]。众多研究表明逆境能影响植物内源激素的含量及其生物活性,通常表现为ABA等抑制类内源激素含量会显著增加,而GA,IAA等促进类内源激素含量则下降,从而调控植物体内的代谢生理过程和抗逆性[27]。单贵莲等[28]研究指出,在化感物质的胁迫下,紫花苜蓿幼苗GA,ZT,IAA合成受阻,激素平衡受到破坏,幼苗生长受到影响。郭伟等[29]认为在化感物质的胁迫下,受体植物ABA含量增加抑制IAA的合成,进而调控GA含量下降。本研究表明,大狼毒根、茎叶浸提液处理使多年生黑麦草幼苗GA,IAA,ZT,JA,SA含量下降,ABA含量总体升高,这与单贵莲等、郭伟等研究结果基本一致。本研究中,黑麦草ABA含量随大狼毒浸提液浓度增加表现出上升、下降、再上升的趋势,可能是低浓度大狼毒浸提液促进了多年生黑麦草幼苗ABA合成;随着浸提液浓度增加,多年生黑麦草为保持自身代谢平衡加快ABA代谢[29-30],因此ABA含量降低;随着浸提液浓度进一步增加,多年生黑麦草内源激素平衡被打破[26],ABA代谢受阻,其在幼苗体内的积累量增加。ABA含量增加拮抗调控GA,IAA,ZT,JA,SA等促进类内源激素合成减少[31],影响多年生黑麦草幼苗对水分、养分的吸收,进而抑制细胞生长分裂,减少叶绿素合成,抑制发芽分蘖,加快细胞老化,减弱抗逆性,促进脱落与休眠[26],表现为多年生黑麦草幼苗生长缓慢,甚至衰老死亡。

综上,大狼毒化感物质通过抑制受体植物GA,IAA,ZT,JA,SA等内源激素合成,阻碍ABA代谢,增加MDA的含量,打破受体植物的生理平衡,进而影响受体植物幼苗的生长发育。本研究中,显著抑制多年生黑麦草幼苗生长的最低浸提液浓度为40 g·L-1,这一浓度值显著高于抑制其种子萌发的最低浓度(10 g·L-1),由此推测受体植物种子对大狼毒浸提液反应的敏感性强于幼苗,这有待于对种子内部生理变化进一步探究。

4 结论

大狼毒根、茎叶浸提液对多年生黑麦草种子萌发和幼苗生长均产生明显的化感抑制作用(P<0.05),抑制强度随浸提液浓度升高而增大,以根浸提液抑制强度大于茎叶。在大狼毒的化感胁迫下,多年生黑麦草幼苗MDA含量升高,抗氧化酶POD和CAT活性增加,内源激素GA,IAA,ZT,JA,SA含量下降,ABA含量升高,进而表现为显著抑制多年生黑麦草幼苗的生长(P<0.05)。