基于表型性状的新疆野生黄花苜蓿核心种质构建

2023-11-02于秀明王玉祥

草地学报 2023年10期

于秀明,杜雨,汪鹏,李倩,王玉祥,张博

(新疆农业大学草业学院,新疆乌鲁木齐 830052)

黄花苜蓿(MedicagofalcataL.)具有耐盐碱、抗旱和抗寒等优良抗逆性状,广泛分布于我国北方地区,在新疆北疆地区分布尤为广泛。黄花苜蓿也是进行苜蓿育种改良重要基因源,种群间存在着广泛的遗传多样性,可以与紫花苜蓿进行自然杂交[3-5]。

中国的黄花苜蓿资源丰富、分布广泛且形态变异大,随着地理环境和生态条件的不同,植株的高矮、叶片形状和大小、荚果形状和大小都有很大差异[6],形态差异是种质筛选的重要依据。黄花苜蓿种群间、种群内表型性状差异大,具有丰富的遗传多样性[3,4,7]。相关研究结果表明,苜蓿类群间表型性状的多样性程度与生境呈正相关关系[5,8-10],同时,黄花苜蓿的遗传多样性不仅存在于种群间,不同杂交种之间以及不同个体之间也具有丰富表型性状差异[11]。

核心种质的概念最早是由Frankel等[12]提出的,是以最少数量的遗传资源最大限度的保存整个资源群体的遗传多样性和整个群体的地理分布,以此来提高种质资源的利用和基因挖掘的效率。目前已经在许多植物上应用,如玉米[13]、番茄[14]、菠菜[15]、大豆[16]等作物中,1995年Diwan通过从3 159份一年生苜蓿材料中选出211份材料作为核心种质,构建了一年生苜蓿的核心种质[17],同年,Basigalup等[18]从1 100份多年生苜蓿材料中选出200份材料作为多年生苜蓿核心种质。

为了鉴定出优质的新疆野生黄花苜蓿核心种质资源,本研究选择70份黄花苜蓿种质,对其遗传多样性分析并抽取核心种质,以期为新疆黄花苜蓿育种和新品种选育提供材料基础和理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

材料由新疆农业大学草业学院草种质资源与育种团队提供,来自哈密地区：巴里坤县、阿格喜沃巴村和伊吾县等地共23份,伊犁地区：特克斯县、尼勒克县两地共4份,昌吉地区：玛纳斯县、奇台县等地共14份,阿勒泰地区：布尔津县、哈巴河县、富蕴县、吉木乃县等地共20份,塔城地区：额敏县、西戈壁县、裕民县等地共9份。

2021年7月在新疆农业大学草业学院人工气候室育苗,育苗袋尺寸为10 cm×9 cm×8.5 cm;温度白天25℃,夜间20℃。选择籽粒饱满的种子并将种皮划破从而破除休眠,播种深度为1 cm;萌发期3 d浇水一次,出苗之后5～7 d天浇水一次,生长4周之后进行倍性检验试验,后继续生长2周,于初霜期之前移入新疆农业大学三坪教学实践基地,株行距均为60 cm,次年初花期值成熟期进行形态数据采集。

1.2 试验方法

1.2.1性状调查方法在黄花苜蓿初花期(50%开花)进行数据测量,测量项目及标准如下：

株高(Plant height,PH)：从地表到植株顶部的绝对高度(cm);

节间长(Internode length,IL)：由地面向上第4个节间长度(cm);

茎粗(Stem diameter,ST)：测定节间长的同时测定基部粗度(mm);

茎节数(Number of stem nodes,NS)：测定节间长的同时测定茎节数(个);

单枝花序数(Single branch flower ordinal number,BFON)：主枝上开放的花序以及未开放的花蕾的总数(个);

单序小花数(Number of florets in single order,NFSO)：开花期测定主枝上开放花序的小花总数(个);

花序长(Inflorescence length,IL)：测定花序基部至顶端之间的距离(mm);

花序宽(Inflorescence width,IW)：测定花序中间部位的宽度(mm);

小花长(Floret length,FL)：小花花萼基部到花冠顶端之间的垂直距离(mm);

叶长(Leaf length,LL)：主茎上从上向下数第四个叶片中间小叶长度(mm);

叶宽(Leaf width,LW)：主茎上从上向下数第四个叶片中间小叶宽度(mm);

叶面积(Leaf area,LA)：主茎上从上向下数第四个叶片中间小叶面积(mm)。

在成熟期(荚果成熟70%)进行下列数据的测量：

荚长(Pod length,PL)：随机选取30个成熟荚果,测量荚长(mm);

荚宽(Pod width,PW)：随机选取30个成熟荚果,测量荚宽(mm);

荚厚(Pod thickness,PT)：随机选取30个成熟荚果,测量荚厚(mm);

单荚种子数(Number of seeds per pod,NSPP)：测定 100 粒荚果含种子数,相差小于 5%时,取平均值(粒);

种子长(Seed length,SL)：随机选取100个成熟饱满种子,测量种子长(mm);

种子宽(Seed width,SW)：随机选取100个成熟饱满种子,测量种子宽(mm);

种子厚(Seed thickness,ST)：随机选取100个成熟饱满种子,测量种子厚(mm);

指标测量方法参考李志勇等[19]指定的《苜蓿种质资源描述规范和数据标准》。

1.2.2种质资源的遗传多样性计算所有性状的均值(Mean,X)、极大值(Max.)、极小值(Min.)、极差(Range)、表型方差(Phenotypic variance)、变异系数(CV)和标准差(Standard deviation,s)等。根据计算结果将所有材料每个性状划分为10个等级,按第1级[Xi<(X-2 s)]到第10级[Xi≥(X+2 s)],每0.5 s为1级,每1级的相对频率(Pi)用于计算多样性指数。遗传多样性指数即Shannon-Wiener index(H’)信息指数。Xi为第i级别中的数据[20-22]。

1.2.3核心种质库的构建对新疆野生黄花苜蓿的表型性状进行主成分分析和聚类分析。聚类分析中遗产距离为欧式距离(Euclidean distance),聚类方法采用离差平方和法(Ward’s method)[23]。

根据各子集的遗传多样性分别采用随机、位点优先和偏离度取样策略,在聚类方法和取样策略的基础上选取5个抽样比例(10%,15%,20%,25%,30%),对以上取样策略进行检验,比较选择出构建新疆野生黄花苜蓿核心种质的最终策略。

1.2.4核心种质代表性评价利用均值差异百分率(Mean difference percentage,MD%)、方差差异百分率(Variance difference percentage,VD%)、极差符合率(Coincidence rate of range,CR%)和变异系数变化率(Variable rate in C.V.,VR%)作为评价参数[24],利用均值、极值、极差、表型方差、变异系数等评价核心种质的代表性[25]。

1.2.5倍性检验方法使用参照Sysmex Partec GmbH Arndtstraβe 11 a-b试剂盒使用方法。

1.3 数据处理

采用Excel 2013进行数据处理与分析,利用SPSS 20.0软件进行聚类及方差分析。

H′=-∑Pi×LnPi

式中Pi为某形状第i级别内材料分数占总份数的百分比,

其中St是核心子集与原始群体t检验得到的均值差异显著(P=0.05)的性状数,n是性状总数。

其中SF是核心子集与原始群体F检验得到的方差差异显著(P=0.05)的性状数,n是性状总数。

其中Rc为核心种质库性状的极差,Ri是原有遗传资源性状的极差,n是性状总数。

其中CVc为核心种质库性状的变异系数,CVi是原始群体的变异系数,n是性状总数。

2 结果与分析

2.1 主要农艺形状的遗传多样性分析

70份黄花苜蓿种质资源各性状变异系数范围为14.23%～34.66%,平均变异系数为24.05%(表1)。其中,单枝花序数的变异系数最大为34.66%,变异幅度为8.0～32.0个,叶长的变异系数最小为14.23%,变异幅度为4.94～15.80 mm。19个性状的遗传多样性指数分布在1.459 8～2.051 3之间,平均遗传多样性指数为1.924 6,遗传多样性指数最高的为叶宽2.051 3,最低的为单荚种子数1.459 8。材料具有较大的变异幅度、较高的遗传多样性,因此,本研究所选种质资源间的遗传差异大,资源类型丰富,利于特异种质的筛选和核心种质的抽提。

2.2 主要农艺性状主成分分析

对19个主要农艺性状进行主成分分析,提取到特征值大于1的主成分6个,累计贡献率为74.131%,反映出表型性状的变异存在多向性,主成分的特征值分别为3.393,2.136,1.936,1.787,1.288,1.206,包含了19个主要农艺性状的绝大部分信息,表明这5个主成分能够反映所调查性状的基本特征(表2)。

其中第1主成分的贡献率为21.096%,其中株高、单枝花序数、花序长、花序宽和单序小花数的特征向量绝对值较高,表明第1主成分主要反映花部性状特征;第2主成分的贡献率为14.856%,其中叶长、叶宽、叶面积的特征向量绝对值较大,表明第2主成分反映叶片性状特征;第3主成分贡献率11.24%,其中小花长、种子长、种子宽的特征向量绝对值较大,三者属于结实特征因子;第4主成分贡献率10.19%,其中种子宽和种子厚特征向量绝对值最高,二者为果实特征因子;第5主成分贡献率9.404%,单荚种子数特征向量绝对值最高,此为种子产量特征因子;第6主成分贡献率7.345%,荚长和荚厚特征向量绝对值相对较高,二者可称为荚果特征因子。

表1 黄花苜蓿种质资源性状的一般性描述及变异情况Table 1 General description and variation of traits of Medicago falcata L. germplasm resources

表2 黄花苜蓿种质资源主要农艺性状的主成分分析Table 2 Principal component analysis of major agronomic traits of M. falcata L.germplasm resources

2.3 构建核心种质的取样策略

3种取样策略和5取样比例中,所得种质资源库的均值差异百分率均低于20%,极差符合率均大于80%[26-28];通过比较变异系数变化百分率(表3),位点优先取样策略明显优于其他两种取样策略,在位点优先取样策略中,取样比例为30%时,所得种子资源库最优;使用离差平方和法进行聚类,遗传距离为欧氏距离,取样策略为位点优先取样,取样比例为30%时,构建的核心种质能够较好的保留原始种质的表型性状并有效降低遗传冗余度。通过上述最优方法选择出初级核心种质19份。

倍性检验共得到68份四倍体材料,1份二倍体材料和1份复合体材料,由于二倍体和复合体材料相对稀少,故将二者编入核心种质中,得出核心种质共21份,如表4所示。

表3 不同策略取样的种质资源与原种质性状差异Table 3 Trait differences between germplasm resources sampled by different strategies and the original germplasm

表4 核心种质来源及倍性信息Table 4 Source and ploidy information of core germplasm

2.4 核心种质代表性的评价

核心种质的均值差异百分率(MD%)为0.00%,各性状均不存在显著差异;各性状的极差符合率(CR%)为97.14%,表明核心种质保留了原始群体中的特殊种质;各性状指标的变异系数变化率(VR%)为115.87%,变异系数均高于原始群体,表明核心种质具有良好的异质性;各项指标方差差异百分率(VD%)为5.26%,除株高、茎节数、荚长、荚宽、荚厚、单荚种子数外,其余方差显著高于原始群体,表明核心种质获得了较大的变异(表5)。

表6所示,利用主成分分析对21份黄花苜蓿核心种质资源与原种质资源比较分析,二者均有6个主成分特征值大于1,包含各性状74%以上的遗传多样性信息,并且二者累计贡献率差异不明显,也证明所构建的核心种质资源代表性和可靠性较高。

表5 原始种质与核心种质间P值的比较Table 5 Comparison of P values between original germplasm and core germplasm

表6 原种质资源与核心种质资源主成分比较Table 6 Comparison of principal components of original germplasm resources and core germplasm resources

3 讨论

表型性状差异是遗传多样性最直观的表现,基于表型进行遗传多样性分析,能够直观展示种质资源群体的遗传结构,有助于种子的选择和利用[25]。一般建立核心种质资源库步骤为：数据的收集整理,对收集数据进行分组,种质的抽样,核心种质确定及有效性检验,即首先通过对收集材料进行分组,在组内通过合适的抽样策略和抽样比例筛选核心种质,通过一定的统计参数检验核心种质库的代表性[29-30]。

黄花苜蓿在抗旱、耐盐碱、抗寒等方面均有相应的研究[31-34],新疆具有丰富的野生黄花苜蓿资源,但是开展的研究却很少,主要因为新疆幅员辽阔,黄花苜蓿未进行系统化的收集整理工作,无法高效的对其进行开展研究。本研究基于70份新疆野生黄花苜蓿种质资源的19个表型性状进行遗传多样性分析,发现材料的变异系数高于10%,则样本间差异显著[35-37],本研究中19个性状的变异系数均大于10%,性状之间差异明显;多样性指数能反映遗传多样性的丰富度,遗传多样性指数越高,则表明性状多样性丰富度越高[37],研究中19个性状的平均遗传多样性指数为1.9246,遗传多样性指数较高,表明所选用的材料具有较高的离散程度,资源类型丰富。

按照MD%≤20%、CR%≥80%原则,VR%和CR%越大就越能够代表原种质群体的遗传多样性[26-28],本研究抽取的核心种质MD%=0.00%,CR%=97.14%符合上述原则,且VR%=115.87%,说明所选核心种质能够基本上代表全部种质资源的遗传多样性。通过主成分分析比较核心种质与原种质资源的累计贡献率,发现二者的累计贡献率均大于74%,也从另一方面也说明所筛选的核心种质具有一定的代表性。

目前,遗传多样性分析和主成分分析等方法已成为分析种质资源表型多样性的常用手段,被广泛应用在种质资源的鉴定和评价中[38]。本研究的不足之处在于仅对材料样本的表型性状进行了研究,形态学指标具有局限性,如环境变化可能会导致材料形态发生变化,后续应结合分子层面的相应技术手段,多方面多层次的对新疆野生黄花苜蓿种质资源进行鉴定,从而提高鉴定的科学性和准确性。