无芒雀麦和燕麦种子萌发过程中叶绿体光合变化

田沛鑫,宋 瑞,李超然,倪浩然,王 润,刘 萍,张 涵,毛培胜,贾善刚

(中国农业大学草业科学与技术学院,北京100193)

光合作用是植物通过光反应和暗反应两个阶段,将太阳光能转变为化学能,以维持植物生长发育的重要生物过程[1]。叶绿体是高等植物进行光合作用的场所,由叶绿体双层被膜、叶绿体基质和类囊体构成。种子萌发是植物生命周期的起点,种子从土壤中萌发到破土的过程,伴随着叶绿体从前质体到黄化质体,再到成熟叶绿体3个发育阶段[2]。高等植物叶绿体的生物发生过程中伴随着各种生理生化的变化,如光合色素的含量变化。光合色素位于叶绿体类囊体膜上,主要分为叶绿素、类胡萝卜素和藻胆素三大类[3-4]。其中,在植物细胞对光能的捕捉过程中,叶绿素起主要作用,类胡萝卜素(包括胡萝卜素和叶黄素)和藻胆素则是对叶绿素捕获光能的补充,又被称为辅助色素。光合色素含量的高低代表着植物的光合能力,在一定程度上也代表着植物生长发育的状态[5]。此外,叶绿素具有荧光现象,其荧光强弱与光合作用碳同化存在相关性,可以作为光合作用研究的重要指标[6]。叶绿素荧光仪基于叶绿素荧光效应,可用于测定植物光合荧光参数,包括：暗适应下最小荧光(Fo)、最大荧光(Fm)、PSII最大光化学量子产量(Fv/Fm)、光适应下PSII反应中心的实际光化学效率(ФPSII)、电子传递效率(Electron translate ratio,ETR)等[7-8]。

多光谱成像技术(Multispectral imaging,MSI)是一种表型组学研究工具,采用了LED滤波技术,组合测量多达20个不同波长并集成到1张高分辨光谱图像中。VideometerLab4是常用的光谱成像设备,集成了照明、相机以及计算机技术,具有数字图像分析以及数据统计能力,用于快速、有效测定生物材料表面颜色、质构、化学组分等[9-12]。该仪器可将植物内在特征转换为不同的光谱信息,结合标准化典型判别分析(Normalized canonical discriminant analysis,nCDA)、线性判别分析、偏最小二乘判别分析和随机森林等数学多元分析模型等,鉴定样品之间的差异[11]。近年来,随着多光谱成像技术的发展,MSI技术已经应用于植物和种子的表型及生理分析。紫花苜蓿(MedicagosativaL.)表型组学研究结果表明,MSI技术能够高准确度识别和鉴定牧草种子的形态特征、判定种子的发芽率和生活力等质量指标[13-15]。Pan等研究成果表明多光谱成像可实现叶绿素a、b含量的无损鉴定[16]。因此,利用多光谱技术快速无损地分析植物表型、关联研究植物生理生化指标的变化规律与响应特性,具有较高的应用前景。

叶绿体是光合作用主要场所,种子萌发过程中胚芽叶绿体的发育状态对植株生长活力、结实和生物产量极其重要[17]。目前叶绿体发育相关研究多集中在模式植物拟南芥中,且对叶片叶绿体的关注较高,针对禾本科牧草胚芽叶绿体的研究极少。无芒雀麦(BromusinermisLeyss.)是一种多年生的禾本科草本植物,具有较强的抗旱、抗寒性[18-19]。无芒雀麦营养成分丰富,适口性好,家畜喜食,是一种优质牧草[20]。燕麦(AvenasativaL.)为一年生禾本科植物,作为一种古老的粮食作物,具有高蛋白、低碳水化合物等特点[21]。燕麦不但可以作为粮食作物,其籽实作为优质饲料还可用于饲喂鸡、猪等家畜家禽[22-24]。因此,了解两种不同的多年生禾本科牧草种子在萌发过程中胚芽叶绿体的发育,对提高牧草光合潜力和产量具有重要意义。本研究以无芒雀麦和燕麦为研究材料,通过模拟种子从黑暗土壤中破土并在光照下生长的过程,测定胚芽出土后光合色素含量和叶绿素荧光参数指标,分析两种试验材料在萌发过程中的表型变化,探究无芒雀麦和燕麦种子萌发过程中叶绿体光合变化和生物发生过程,为叶绿素荧光和多光谱成像技术在牧草种子萌发过程中叶绿体光合变化的相关研究中提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验所用的无芒雀麦品种为‘原野’,在2021年于河北承德市国营鱼儿山牧场基地收获。燕麦品种为‘挑战者’,购买于BrettYoung公司,源于加拿大。无芒雀麦和燕麦种子发芽率分别为94%和99%,发芽势为86%和92%,于中国农业大学牧草种子生理与生产实验室贮藏6个月,贮藏温度为25℃,湿度35%。

1.2 试验设计

对无芒雀麦和燕麦种子进行出土预试验,土壤基质配比为营养土∶蛭石=1∶1,种子播种于花盆内(直径26 cm,高度23.5 cm),播种深度为2.5 cm,花盆放置于人工气候培养室。预试验结果表明,无芒雀麦和燕麦种子出土所需的时间分别是6天和5天,此结果用于后续的遮光处理。

采用培养皿发芽法,在10个方形培养皿(11.5 cm×11.5 cm)中放置3层滤纸作为种床,每个培养皿中放置50粒大小均匀一致的种子,将摆放好种子的培养皿分为两组。为模拟种子胚芽出土前的黑暗生长条件,用锡纸将培养皿包裹两层进行遮光处理,遮光时间按照预试验中胚芽出土时间设置,遮光结束后揭开锡纸,代表种子出土,在光照8 h,黑暗16 h的光周期下继续培养。光照第1天(E0h～E8h)每隔一定时间进行试验测定,光照第2天到光照第4天(E2d～E4d)在上午10点和下午6点进行测定。

1.3 测定指标与方法

1.3.1发芽指标的测定 各取100粒大小均匀一致的无芒雀麦和燕麦种子,放置于方形培养皿(11.5 cm×11.5 cm)中,加入3层滤纸作为种床,用移液枪注入10 mL去离子水将滤纸湿润,置于20℃恒温培养箱中培养,每个处理设置4个重复。培养期间每天于固定时间点对发芽种子数进行统计,并根据规定计算种子的发芽势和发芽率。

(1)

(2)

1.3.2多光谱成像系统数据采集 使用VideometerLab光谱成像设备,组合测量多个不同波长并集成到1张高分辨光谱图像中,进行两种试验材料在萌发过程中的表型变化判定分析,对拍摄所得到的图像进行归一化典型判别分析(nCDA)、灰度图分析和RGB分析。采集多光谱数据之前,需要针对不同光谱特征的种子,对指定样品的光谱信息进行标准化,对不同光谱强度的感兴趣区域进行标记和着色。本研究分别使用红色和蓝色对初始和最终的幼苗MSI图像进行标准化,其他图像采用Videometer软件version 4中MSI-transformation Builder的nCDA函数进行相应的转换[8]。

1.3.3种子萌发过程中光合色素含量的测定 揭开锡纸后以随机重复的方式收集无芒雀麦胚芽,称重记录,设置3个重复。将胚芽剪成细丝转移到2 mL的试管中,加入1.5 mL浓度80%丙酮,在遮光、室温(22℃)条件下过夜浸提,直到胚芽完全变白。以80%丙酮为空白样品,使用分光光度计测定663 nm,645 nm和470 nm处的吸光度值[25-27]。根据以下公式计算叶绿素和类胡萝卜素的浓度：

叶绿素浓度=叶绿素a+叶绿素b

=(12.21×A663-2.81×A645)+(20.13×A645-5.03×A663)

=7.18×A633+17.32×A645

类胡萝卜素浓度=(1000×A470-3.27×Ca-104×Cb)÷229

光合色素含量(mg·g-1)=C(mg·L-1)×提取液总量(mL)/稃片重量(g)×1000

式中,Ca为叶绿素a浓度;Cb为叶绿素b浓度。A663,A645和A470分别为叶绿体色素提取液在波长663 nm,645 nm和470 nm下的吸光度。

1.3.4叶绿素荧光参数测定 使用FMS-2便携脉冲调制式荧光仪对无芒雀麦的胚芽叶绿体荧光参数进行测定,随机重复3次进行试验。由于胚芽过于纤细,故需要将多个胚芽无间隙地摆放在一起进行测定,测量部位统一位于胚芽的中上部。在测定过程中先进行光适应参数(Fs,Fm′,Fo′,Fv′,Fv′/Fm′,ФPSII,ETR)的测定,待经过20 min的遮光处理后再进行暗适应参数(Fo,Fm,Fv,Fv/Fm)的测定[28-29]。

1.4 数据分析

利用Excel 2019对数据进行整理和计算,借助软件GraphPad Prism 8对试验结果进行作图分析,所有结果用“均值±标准差(mean±SD)”表示。

2 结果与分析

2.1 无芒雀麦和燕麦胚芽的多光谱图像分析

通过nCDA图、RGB图和灰度图的分析,无芒雀麦胚芽在照光后,在E0h,E2h,E3hE4h,E5h,E6h,E2d,E3d,E4d表型存在剧烈的变化(图1a)。随着光照的时间的延长,无芒雀麦胚芽表型由黄变绿,nCDA图由蓝色变黄,最后变为红色。

随着光照时间的延长,燕麦胚芽表型由黄变绿,nCDA图由蓝色向红色转变,变化较为剧烈的时间节点分别为E0h,E0.5h,E1h,E1.5h,E2h,E3.5h,E4h,E4.5h,E7h,E9h,E2d,E3d(图1b)。

2.2 无芒雀麦种子萌发胚芽生理生化变化

2.2.1无芒雀麦种子萌发过程中光合色素的变化 如图2所示,在经过为期5天的光照后,叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素含量均增加。在胚芽见光的第1天,即从E0h—E8h时间段内叶绿素a和叶绿素b含量接近于0,在E2.5h含量略微上升,在E1d开始迅速积累,类胡萝卜素在E8h时达到较高值,在E1d时迅速下降后又迅速上升。叶绿素、叶绿素a、叶绿素b、类胡萝卜素在第5天时的含量分别达到了第1天含量的9.322,12.311,3.412和1.813倍。

图1 揭开锡纸前3天无芒雀麦(a)和燕麦(b)胚芽的多光谱nCDA图Fig.1 MSI nCDA images of plumule during the first 3 days after being exposed to light in smooth bromegrass (Panel a) and oat (Panel b)

2.2.2无芒雀麦种子萌发过程中叶绿体荧光参数的变化 通过测定无芒雀麦暗适应下叶绿体荧光参数发现,各项指标随种子萌发时间延长均呈现上升趋势,初始荧光产量Fo、最大荧光产量Fm呈现出相似的变化趋势,在E0h—E8h呈上升趋势,在E1 d大幅度下降。PSII最大光学效率Fv/Fm在E0h—E1h略微下降,E1h—E1d迅速上升,E1d后数值趋于稳定(图3)。光适应参数Fs,Fo′,Fv′,Fm′与暗适应变化规律相似,在E1d时下降到较低点,随后进入快速上升阶段,E4d时达到P值。PSII有效光化学量子产量Fv′/Fm′与Fv/Fm变化趋势相似,Fv′/Fm′以E2.5h为转折点,在E2.5h—E1d时间段内Fv′/Fm′逐渐上升后稳定。暗适应下的初始荧光产量、最大荧光产量均高于光适应时期数值。PSII实际光化学效率ФPSII和PSII电子传递速率ETR变化趋势与Fv/Fm和Fv′/Fm′相似,在E40min出现下降,在E1h—E1d数值波动变化(图4)。

图3 无芒雀麦暗适应叶绿体荧光参数Fig.3 Chloroplast fluorescence parameters under dark adaptation in smooth bromegrass

图4 无芒雀麦光适应叶绿体荧光参数Fig.4 Chloroplast fluorescence parameters under light adaptation in smooth bromegrass

2.3 燕麦种子萌发胚芽生理生化变化

2.3.1燕麦种子萌发过程中光合色素的变化 由图5所示,燕麦幼苗叶绿体光合色素含量总体呈现出与无芒雀麦相同的上升趋势,其中叶绿素a和叶绿素b在E1h时基本未合成,在E2.5h后含量开始上升,主要在E1d—E5d期间合成,叶绿素含量在E1d下降到较低点后,含量迅速增加。类胡萝卜素的初始含量为0.02 mg·g-1,在黑暗下正常合成,在E8h达到较高点,在E1d迅速下降后又上升,此后稳定在较高水平。

图5 燕麦光合色素含量变化Fig.5 Photosynthetic pigment content of oat

2.3.2燕麦种子萌发过程中叶绿体荧光参数的变化 燕麦的暗适应和光适应各项指标整体上均呈现上升趋势。其中,暗适应参数Fo,Fm,Fv变化趋势相似,在E0h—E1d都没有发生显著变化,E1d之后数值急速增加达到最大值,E4d和E5d数值均在峰值上下波动。Fv/Fm整体呈现上升趋势,在光照40 min时明显上升,达到最大值,随后在E1h迅速下降,E1h—E1d逐渐上升,E1d后趋于稳定(图6)。与暗适应下的光合参数相比,光适应下的荧光参数Fs,Fo′,Fm′,Fv′表现出相同趋势的变化特征,在E1d时发生轻微下降,E1d后数值迅速增加。Fv′/Fm′与Fv/Fm响应曲线相似,在E40min时出现峰值,随后在E1h时迅速下降,在E1h—E2d逐渐上升,随后趋于平缓。ФPSII和ETR在E1h时数值下降到原本的1/4,此后持续回升,在上下波动中趋于稳定(图7)。

图6 燕麦暗适应叶绿体荧光参数Fig.6 Chloroplast fluorescence parameters under dark adaptation in oat

图7 燕麦光适应叶绿体荧光参数Fig.7 Chloroplast fluorescence parameters under light adaptation in oat

3 讨论

多光谱成像技术可以快速、无损获取不同发育状态的种子、幼苗组织和幼苗等的光谱和形态信息,在植物幼苗光合相关生理指标表型分析研究中具有强大的应用前景。nCDA分析可以有效鉴别不同生理状态的植株或种子状态的差异,如判别不同活力的多年生黑麦草(Loliumperenne)种子[30]、区分老化和未老化的豇豆(Vignaunguiculata)种子[31]等。在本试验中,我们通过nCDA模式下胚芽图片颜色的变化,识别出了无芒雀麦和燕麦种子萌发不同时间下胚芽发育状态的差异,发现了无芒雀麦胚芽快速发育的时间节点E0h,E2h,E3h,E4h,E5h,E6h,E2d,E3d,E4d,燕麦胚芽快速发育的时间节点E0h,E0.5h,E1h,E1.5h,E2h,E3.5h,E4h,E4.5h,E7h,E9h,E2d,E3d,在一定程度上可以反映无芒雀麦和燕麦幼苗的光合响应特征。

无芒雀麦和燕麦是通过色素蛋白复合体对光能进行捕捉从而来进行光合作用的,幼苗光合色素含量直接反映了植物叶片光合能力的大小[5],光合色素的含量的变化可以反映出幼苗的生理情况[32-34]。本试验在揭开锡纸后对种子萌发过程中光合色素含量进行测定,发现叶绿素a和叶绿素b的初始含量均接近于0,在光照条件下随着萌发时间的延长,无芒雀麦和燕麦幼苗中的叶绿素a、叶绿素b、类胡萝卜素含量在总体上呈现出明显的上升趋势[35]。值得注意的是,无芒雀麦和燕麦光合色素含量表现出相同的响应规律,叶绿素a和叶绿素b在E1d后含量迅速上升,类胡萝卜素含量在E1d时发生小幅度下降后升高。叶绿素含量与植物对外界光照强度适应能力密切相关[36],种子感光性主要受光敏色素的调控[37],因此推断胚芽在揭开锡纸后1 h内对光照的适应能力较弱,主要在合成光敏色素响应光信号,可能导致了叶绿素含量在E0h—E1h期间含量低。类胡萝卜素是对叶绿素捕获光能的补充,又被称为辅助色素,是叶绿体内重要的非酶促抗氧化系统[38],类胡萝卜素含量在E1d时出现下降,可能与叶绿体内光保护机制有关[39-40]。

叶绿素荧光可以对光合作用进行准确而有效的反映,可以表现出PSII反应中心的活性和植物光合作用的强弱。Fo反映植物光能利用能力,Fm反映植物光合活性大小[41]。本试验中Fo和Fm在E1d之前保持较低的水平,E1d之后数值上升,呈现上下波动的状态,说明光反应中心在E1d前保持较高的活性,胚芽的光能利用能力逐渐增强。Fv/Fm反映了光反应中心PSII的最大光能转换效率,无芒雀麦和燕麦Fv/Fm和Fv′/Fm′变化规律整体相似。植物在非胁迫环境下,Fv/Fm稳定在0.80～0.85,低于0.75可认为植物受到了光抑制[42]。光照前期无芒雀麦和燕麦的Fv/Fm均低于正常值,在光照一定时间后恢复正常值,说明在暗适应下,幼苗的光化学反应过程受到了一定程度的抑制。在光适应下,无芒雀麦和燕麦的Fv′/Fm′值均呈现下降后上升的趋势。无芒雀麦Fv/Fm在E1h—E1d数值迅速上升,Fv′/Fm′值在E2.5h—E1d逐渐上升,E1d后趋于稳定。燕麦Fv/Fm和Fv′/Fm′主要在E1h—E1d期间逐渐上升,E1d后不再大幅度增加。ФPSII和ETR均可作为评价植物实际光化学效率的指标,本研究中ФPSII和ETR整体呈稳定状态,无芒雀麦ФPSII和ETR在E40min时呈现下降趋势,燕麦ФPSII和ETR在E1h时出现大幅度下降。综上所述,无芒雀麦和燕麦在E1h—E1d期间,光合色素含量和PSII反应中心活性迅速增加,因此E1h—E1d可被看作是叶绿体发育的主要阶段,在E1d之后光合色素和叶绿体荧光参数趋于稳定,意味着叶绿体发育基本成熟,能够进行正常的光合作用。

4 结论

本试验利用多光谱和nCDA分析,鉴别出无芒雀麦和燕麦种子在萌发过程中不同时间节点发育状态的差异,并获取了胚芽表型发生变化的关键时间节点(揭开锡纸1～2小时),这与胚芽内光合色素含量的变化具有相关性。随着萌发时间的延长,无芒雀麦和燕麦种子萌发过程中光合色素含量逐渐积累,叶绿素a和叶绿素b在E1h之前未发生合成,E1h—E1d为叶绿素的快速积累阶段。PSII反应中心活性在E1h—2.5h开始变化,直到E1d后趋于稳定,在此期间叶绿体逐渐发育,PSII反应中心活性迅速增加,E1d后叶绿体结构基本发育完全。