不同品种紫花苜蓿种子萌发期耐低温性综合评价

张 昭,金琪凡,史彦欣,段晓桐,闫慧芳*

(1.青岛农业大学草业学院,山东 青岛 266109;2.黄河三角洲草地资源与生态国家林业和草原局重点实验室,山东 青岛 266109;3.青岛市滩涂盐碱地特色植物种质创制与利用重点实验室,山东 青岛 266109)

种子萌发是植物整个生命周期中最关键的阶段,也是对环境因子响应最敏感的时期[1]。作为种子萌发过程的重要环境因子,温度影响了大部分的种子萌发相关生理生化反应事件[2-3]。低温冷害是常见于晚秋或早春的主要农业气象灾害[4],也是植物生命周期中极易遭受的非生物胁迫因子,严重限制了植物的地理分布、生长发育和产量[5-6]。当温度低于种子萌发适宜温度时,种子萌发受到抑制,萌发速率减慢,种子活力和幼苗生长特性均受到一定程度影响[7]。

紫花苜蓿(MedicagosativaL.)是世界上栽培历史最悠久、种植面积最大的重要豆科牧草,具有适应范围广,产草量高,蛋白质、维生素和矿物质等营养物质丰富等特性[8]。在我国,紫花苜蓿主要栽培区域集中在北方地区,且通常于晚秋或早春季节播种,但由于温度低及倒春寒现象,致使其因种子萌发缓慢、出苗率低而制约田间成功建植,进而影响其产量和品质[9]。此外,不同品种紫花苜蓿种子的萌发特性及萌发期对低温的抵抗能力也存在差异[10]。近年来,尽管紫花苜蓿种子的低温萌发和幼苗生长特性已被研究报道[7-13],但关于不同品种种子对低温胁迫萌发响应的差异比较与综合评价还较少。因此,深入探究紫花苜蓿种子在低温条件下的萌发和幼苗生长特性,据此综合比较并评价不同品种种子的耐低温萌发能力,对其田间播种、成功建植、栽培生产十分重要,也对其适应性品种筛选、推广及人工草地扩大种植具有重要指导意义。

本研究以22个品种紫花苜蓿种子为试验材料,通过测定各品种在标准发芽温度(20℃)和低温(10℃)下的种子发芽势、发芽率、苗长、根长等9个种子萌发和幼苗生长特性相关指标,分析比较不同品种紫花苜蓿种子萌发和幼苗生长对低温胁迫的响应差异,并对不同品种种子萌发期的耐低温性进行综合评价,以期为紫花苜蓿耐低温种质筛选、低温响应基因挖掘以及耐低温新品种培育提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试紫花苜蓿种子材料包括22个品种,于2020年收获后均保存于—20℃冰箱内备用(表1)。本试验于2022年11月—2023年2月在青岛农业大学草业学院实验室进行。

表1 22个供试紫花苜蓿品种基本信息Table 1 Basic information of the 22 tested alfalfa varieties

1.2 试验设计与方法

本试验设置标准发芽温度(20℃,即对照CK)和低温胁迫(10℃)两种处理对上述22个品种的紫花苜蓿种子进行萌发试验与幼苗生长特性测定。挑选均匀饱满、大小一致的紫花苜蓿种子50粒,将其均匀放置于铺有3层滤纸的11 cm×11 cm有盖培养皿中,滤纸用10 mL蒸馏水润湿,每个处理设3次重复。将培养皿置于光照培养箱(GXZ-380B)中,分别在20℃和10℃、光照8 h/黑暗16 h条件下培养10 d。种子萌发期间,每天观察统计种子发芽和幼苗生长情况,并定时补充蒸发散失的水分,以维持种子萌发和幼苗生长所需。

1.3 指标测定

以胚根突破种皮至少2 mm作为种子萌发标准,以正常种苗形态建成作为成苗标准,每天观察统计种子萌发和成苗情况。根据每天种子萌发和成苗统计,分别于第4 d计算种子发芽势(Germination energy,GE)、第10 d计算种子发芽率(Germination percentage,GP)和成苗率(Seedling percentage,SP)。待第10 d发芽结束后,每个培养皿随机选取10株正常种苗,用刻度尺测定苗长(Shoot length,SL)和根长(Root length,RL),并用天平称量幼苗鲜重(Seedling fresh weight,SFW)。此外,计算种子发芽指数(Germination index,GI)、种子活力指数(Vigor index,VI)和幼苗活力指数(Seedling vigor index,SVI)。

发芽势(GE)=(N4/N)×100%

发芽率(GP)=(N10/N)×100%

成苗率(SP)=(G10/N)×100%

种子发芽指数(GI)=∑(Nt/Dt)

种子活力指数(VI)=(∑Nt/Dt)×SFW

幼苗活力指数(SVI)=(SL+RL)×SP

上述公式中,N4和N10分别为第4 d和第10 d统计时的萌发种子数,G10为第10 d统计时的正常种苗数,N为供试种子总数,Nt为第td统计时的萌发种子数,Dt为萌发天数。

1.4 耐低温性综合评价

采用耐冷系数(Cold tolerance coefficient,CTC)、综合耐冷系数(Comprehensive cold tolerance coefficient,CCTC)、隶属函数、系统聚类分析的综合评价方法[14]对22个供试品种紫花苜蓿种子萌发期耐低温性进行评价。

耐冷系数(CTC)=低温胁迫条件的指标平均值/常温条件的指标平均值

参考韩瑞宏等[15]的方法,以供试品种各指标测定值为依据,采用隶属函数法对22个品种紫花苜蓿种子萌发期耐低温性进行综合评价。同时,基于综合耐冷系数和隶属函数值,采用欧氏距离中的组间连接法进行系统聚类分析。

μ(Xi)=(Xi-Xmin)/(Xmax-Xmin),i=1,2,3……n

式中,μ(Xi)为某一测定指标的模糊隶属函数值平均值;当指标与种子萌发耐低温性成负相关时用1-μ(Xi)表示;X为某一测定指标平均值;Xmax和Xmin分别为某一测定指标的最大值和最小值。再将各品种种子的各测定指标隶属函数值累加,求隶属函数平均值,值越大表示紫花苜蓿种子萌发期耐低温性越强。

1.5 数据统计与分析

采用Microsoft Excel 2021软件进行数据整理,SPSS 25.0软件进行显著性统计分析与聚类分析。所有数值均以3个重复的“平均值±标准误”(Mean±SE)表示,并用单因素方差分析(ANOVA)检验计算相关参数。

2 结果与分析

2.1 不同品种紫花苜蓿种子萌发期耐低温性的差异比较分析

相比于CK,低温胁迫后各项测定指标的平均值均有所下降,且在不同品种间存在明显差异,达到极显著水平(P<0.01),说明低温胁迫对紫花苜蓿种子萌发和幼苗生长特性所有测定指标影响显著。

标准萌发温度下各测定指标的变异系数范围为2.16%～19.49%,而低温胁迫下各测定指标的变异系数范围为2.38%～20.72%,表明不同测定指标所受低温胁迫的抑制程度存在差异。低温胁迫下,紫花苜蓿种子活力指数与幼苗活力指数所受影响较大,下降幅度分别为69.05%和63.55%,而种子发芽势与发芽率所受影响较小,下降幅度分别为4.15%和1.08%(表2)。基于此,不同品种紫花苜蓿种子萌发期的耐低温性存在差异,可进一步利用其他统计分析方法对其进行分析与综合评价。

表2 不同品种紫花苜蓿种子各测定指标相关统计参数Table 2 Statistical parameters related to various measured indicators of different varieties of alfalfa seeds

2.2 不同品种紫花苜蓿种子萌发期测定指标的耐冷系数分析

根据CK和低温胁迫条件下各测定指标值,计算各品种测定指标的耐冷系数和综合耐冷系数。结果发现,各品种紫花苜蓿种子萌发期对低温胁迫的耐受程度不同,其中‘赛迪10号’的综合耐冷系数最大,为0.683;而‘英斯特’的综合耐冷系数最小,为0.523,且各项测定指标的耐冷系数值也均小于‘赛迪10号’,表明‘赛迪10号’种子萌发期耐低温性最强,而‘英斯特’种子萌发期耐低温性最弱(表3)。

表3 不同品种紫花苜蓿种子各测定指标的耐冷系数Table 3 Cold tolerance coefficient of various measured indicators of different varieties of alfalfa seeds

2.3 不同品种紫花苜蓿种子萌发期测定指标的隶属函数分析

以供试品种各指标测定值为依据,计算各品种测定指标的隶属函数,以比较22个品种紫花苜蓿种子萌发期的耐低温性差异。其中,隶属函数平均值越大,说明种子萌发期的耐低温性越强。结果发现,低温胁迫后,‘赛迪10号’各测定指标的隶属函数平均值最大,为0.789,而‘英斯特’‘金皇后’‘巨能401’各测定指标的隶属函数平均值最小,分别为0.318,0.313,0.313,表明‘赛迪10号’种子萌发期耐低温性最强,而‘英斯特’‘金皇后’‘巨能401’种子萌发期耐低温性较弱(表4)。

表4 不同品种紫花苜蓿种子各测定指标的隶属函数Table 4 Membership functions of various measured indicators of different varieties of alfalfa seeds

2.4 紫花苜蓿种子萌发期耐低温性综合评价

根据综合耐冷系数,通过系统聚类分析将22个供试品种紫花苜蓿种子萌发期耐低温性划分为4个类型,其中,强耐低温性品种1个,占供试品种的4.55%,为‘赛迪10号’;中耐低温性品种11个,占供试品种的50.00%;弱耐低温性品种7个,占供试品种的31.82%;低温敏感性品种3个,占供试品种的13.64%,为‘金皇后’‘巨能995’和‘英斯特’(图1A)。

根据隶属函数,通过系统聚类分析将22个供试品种紫花苜蓿种子萌发期耐低温性划分为4个类型,其中,强耐低温性品种1个,占供试品种的4.55%,为‘赛迪10号’;中耐低温性品种6个,占供试品种的27.27%;弱耐低温性品种11个,占供试品种的50.00%;低温敏感性品种4个,占供试品种的18.18%,为‘巨能995’‘金皇后’‘巨能401’和‘英斯特’(图1B)。

图1 基于综合耐冷系数(A)与隶属函数(B)的系统聚类分析Fig.1 Cluster analysis based on comprehensive cold tolerance coefficient (Panel A) and membership function (Panel B)注：类型Ⅰ,强耐低温性;类型Ⅱ,中耐低温性;类型Ⅲ,弱耐低温性;类型Ⅳ,低温敏感性Note：Type Ⅰ,strong low temperature tolerance;Type Ⅱ,medium low temperature tolerance;Type Ⅲ,weak low temperature tolerance;Type Ⅳ,low temperature sensitivity

因此,根据各品种测定指标的综合耐冷系数(表3)和隶属函数(表4),结合聚类分析结果,将供试紫花苜蓿种子萌发期相对耐低温等级划分为4类,分别为强耐低温性、中耐低温性、弱耐低温性和低温敏感性(表5)。

表5 供试紫花苜蓿种子萌发期相对耐低温等级划分Table 5 Classification of relative low temperature tolerance of different varieties of tested alfalfa during seed germination

基于综合耐冷系数与隶属函数两种评价方法,以结果中重复出现(即在两种评价方法中均被鉴定到)为依据进行综合评价,筛选出强耐低温性品种1个,为‘赛迪10号’;低温敏感性品种3个,为‘金皇后’‘巨能995’和‘英斯特’。然而,进一步分析发现,低温敏感性品种中,‘英斯特’的综合耐冷系数值最低(为0.523),且其种子萌发与幼苗生长特性各项指标的隶属函数平均值与‘巨能995’‘金皇后’相差不大,因此,确定紫花苜蓿种子萌发期的低温敏感性品种为‘英斯特’。

3 讨论

种子萌发是植物生长发育的起始阶段,也是整个生命周期中最关键的时期[16]。种子萌发不仅与种子本身的生物学特性有关,还与周围环境(如水分、氧气和温度等)密切相关。温度是影响种子萌发的关键环境因素,适宜温度下,种子吸胀速率和萌发进程较快,而温度过低则会导致种子吸胀速率减慢,萌发进程受阻[17]。研究表明,发芽势、发芽率、发芽指数、活力指数、简化活力指数、根长、苗长、可溶性糖、淀粉等指标可以反映紫花苜蓿种子在低温胁迫下的种子活力和幼苗生长特性[10-11,18-19]。本研究利用发芽势、发芽率、发芽指数、种子活力指数、成苗率、苗长、根长、幼苗鲜重和幼苗活力指数9个指标进行紫花苜蓿种子萌发期耐低温性综合评价,结果发现,各项测定指标的平均值在低温胁迫下均有所下降,且在不同品种间的差异均达到极显著水平(表2),表明这些指标能够全面地反映不同品种紫花苜蓿种子萌发期对低温胁迫的耐受性差异,可以提高鉴定结果的可靠性。

研究表明,低温胁迫导致紫花苜蓿种子发芽率显著降低,发芽时间延长,幼苗生长缓慢,细胞生理代谢受阻[20-22]。向上等[23]研究20个品种紫花苜蓿种子在4℃和8℃低温胁迫下的萌发特性也发现,各品种种子的发芽率、发芽势、发芽指数、活力指数及苗长均显著降低,发芽时间延长。本研究中,低温胁迫下22个品种紫花苜蓿种子各项萌发相关测定指标的平均值均低于CK的平均值,且在品种间的下降程度不同,其中种子活力指数和幼苗活力指数变化较大,而发芽势与发芽率变化较小,这可能是因为低温下种子生理代谢活动受到抑制,正常幼苗形态建成受阻,说明低温胁迫对不同品种种子的萌发和幼苗生长相关指标的抑制作用存在差异(表2)。此外,种子发芽势的高低表征了种子萌发过程中发芽种子数达到高峰的快慢。本研究中,低温胁迫导致不同品种紫花苜蓿种子的发芽势明显降低,表明发芽高峰期随温度降低而延后。王晓龙等[10]研究发现,紫花苜蓿种子萌发时对低温胁迫具有一定耐受作用,且6℃为其种子萌发的转折点,温度过低可能会因种子呼吸作用、贮藏物质分解代谢等生理活动减弱而抑制种子萌发[12]。尽管前人研究曾采用4℃或10℃作为紫花苜蓿种子萌发的低温胁迫处理温度[11-12,18,20,23-24],但事实上,在4℃温度条件下种子仅能露白萌发,而不能完成正常幼苗的形态建成(预试验结果,未发表)。因此,本研究选用10℃作为紫花苜蓿种子响应低温胁迫的处理温度,且该温度对不同品种的成苗率和幼苗活力指数影响较大,植株生长较弱,这与高茜等[20]研究结果相一致。

种子萌发期对低温胁迫的响应受多种因素影响,单一指标难以真实地反映出种子的耐低温萌发能力,因此,需采用适宜的测定指标和多元评价方法进行综合分析,以提高结果准确性[11]。贾祥等[18]利用隶属函数法综合评价了4种豆科牧草种子萌发期对低温胁迫的响应,向上等[23]利用打分法对低温胁迫下20个品种紫花苜蓿种子的发芽特征进行综合评价,而侯龙鱼等[12]则采用主成分分析法对6个品种紫花苜蓿种子的耐低温萌发能力进行评价与筛选。本研究基于综合耐冷系数和隶属函数方法对22个品种紫花苜蓿种子萌发期的耐低温性进行了综合评价,初步确定‘赛迪10号’为强耐低温性品种、‘英斯特’为低温敏感性品种。实际生产中,仍需进一步在晚秋或早春季节对筛选的品种进行田间播种以验证并加以利用。此外,针对强耐低温性品种和低温敏感性品种紫花苜蓿种子萌发期的不同阶段进行测序分析,挖掘耐低温关键候选基因,为紫花苜蓿种质遗传改良与耐低温新品种培育提供理论基础。

4 结论

低温胁迫下,22个供试紫花苜蓿品种的种子发芽势、发芽率、发芽指数、种子活力指数、成苗率、苗长、根长、苗鲜重、幼苗活力指数均呈下降趋势,其中种子活力指数和幼苗活力指数所受影响较大,而发芽势和发芽率所受影响较小。基于综合耐冷系数与隶属函数进行系统聚类分析,将22个品种紫花苜蓿划分为4个不同耐低温类型,并筛选出强耐低温性品种为‘赛迪10号’、低温敏感性品种为‘英斯特’。