细胞外液谷氨酸激活星形胶质细胞的离体实验研究*

左婷，高洋，石来敏，袁良杰

（山东第一医科大学临床与基础医学院，山东 济南 250000）

星形胶质细胞是中枢神经系统中最丰富的胶质细胞，参与突触、神经回路和行为调节等功能［1］。星形胶质细胞和神经元紧密嵌入脑组织，在突触处共享突触连接［2］谷氨酸（glutamate,Glu）是中枢神经系统中的一种兴奋性神经递质，神经细胞外液中残留的Glu 通常会导致神经兴奋性毒性［3］。星形胶质细胞通过摄取突触释放到突触间隙的Glu 防止Glu 兴奋毒性［4］。星形胶质细胞通过谷氨酸转运蛋白清除细胞外液中残留的Glu。细胞外Glu 刺激星形胶质细胞胞内储存的钙离子的释放，触发星形胶质细胞向相邻神经元释放谷氨酸［5］。因此，星形胶质细胞通过维持Glu 摄取和释放保持中枢神经系统中Glu 的稳态。大量研究表明，Glu 稳态的打破与精神性疾病、阿尔茨海默病和肌萎缩侧索硬化症等疾病的发生具有重要的关系［6-7］。研究发现，Glu 兴奋毒性主要与神经胶质细胞的能力受损有关［8］。星形胶质细胞是再摄取Glu 的主要细胞。然而，不同浓度的Glu 对星形胶质细胞的影响尚不清楚，因此本研究将揭示不同浓度Glu 对星形胶质细胞的影响，这将为拮抗Glu 的兴奋性毒性提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

谷氨酸粉末由Sigma 公司提供；β-actin（ab8227）购自Abcam（英国剑桥）；胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein,GFAP）和白细胞介素-1β（interleukin-1β,IL-1β）抗体由Cell Signaling Technology 公司提供；抗兔和抗鼠二抗购自Absin Bioscience Inc.（中国上海）。DMEM 培养基、青链霉素双抗均购自美国GIBCO 公司，胎牛血清购自北京Cell Max 公司。

1.2 原代星形胶质细胞培养及处理

采用1～2 d 新生SD 大鼠制备原代星形胶质细胞［9］。从大鼠脑海马组织中分离出星形胶质细胞。取量大鼠脑两侧海马组织，0.125% 胰蛋白酶-0.05%乙二胺四乙酸（EDTA）在37℃下消化海马组织15 min。用含有10% FBS 的DMEM 终止消化。将海马组织吹散成单个细胞，并以1×104/cm2的密度接种在含有10% FBS 的DMEM 的75 cm2培养皿中。24 h 后，用新鲜的完全培养基（含10%FBS、1%青霉素-链霉素的DMEM）替换培养基，并去除悬浮细胞。细胞在37℃、95% 空气、5%CO2培养箱中培养约8 d，细胞生长融合达到90%以上。以210 r/min（18 h，37℃）旋转培养皿用于收集纯化的星形胶质细胞。细胞GFAP 阳性染色率＞98%。不同浓度的谷氨酸（0 μM、25 μM、50 μM、100 μM）与细胞共同作用24 h。

1.3 Western blot 实验技术检测蛋白表达

不同浓度谷氨酸刺激细胞24 h 后，弃掉培养板中的上清液，预冷的0.01 M PBS 冲洗3 遍，加入RIPA 裂解液，冰上裂解40 min，用细胞刮将细胞轻轻刮下，收集裂解液到离心管中，4℃ 12 000 r/min转速离心20 min，吸取上清液。采用BCA 法检测蛋白浓度后，加入5×loading buffer 充分混匀，95℃孵育5 min；然后将蛋白保存于-80℃冰箱，用于Western blotting 检测。将保存好的蛋白，按照每孔15 μg 的蛋白质量进行电泳；电泳结束后，300 mA 恒压转膜90 min，将带有蛋白条带的PVDF 膜封闭于5% 的脱脂牛奶1 h，然后一抗孵育，4℃摇床24 h；然后TBST 洗膜3 遍，二抗孵育，室温1 h；然后加入发光液进行蛋白检测。采用Image J 软件读取蛋白灰度值，进行蛋白含量的分析。

1.4 统计学方法

数据分析采用GraphPad Prism 5.0 统计软件。实验结果用均数±标准差（）表示，比较用单因素方差分析，进一步两两比较用Tukey 法。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 实验结果

2.1 不同浓度的谷氨酸对星形胶质细胞GFAP 蛋白表达的作用

为了检测不同浓度的外源性谷氨酸对星形胶质细胞的激活作用，本实验选用星形胶质细胞的标志物GFAP 进行检测，结果显示，不同浓度的谷氨酸处理星形胶质细胞24 h，与0 μM 组相比，25 μM，50 μM，100 μM 的谷氨酸处理组GFAP 的蛋白表达均有上调的趋势，100 μM 处理组GFAP表达明显上调，差异有统计学意义（P＜0.05）。实验数据见表1。

表1 不同浓度的谷氨酸诱导星形胶质细胞GFAP和IL-1β 蛋白的表达（）

表1 不同浓度的谷氨酸诱导星形胶质细胞GFAP和IL-1β 蛋白的表达（）

注：†与0 µM 组比较，P＜0.05。

2.2 不同浓度谷氨酸诱导星形胶质细胞释放炎性因子IL-1β 蛋白的作用

研究表明激活的星形胶质细胞会释放炎性因子IL-1β，为了检测不同浓度的谷氨酸是否能够激活星形胶质细胞，本实验使用不同浓度的谷氨酸处理星形胶质细胞24 h，利用Western blot 技术检测炎性因子IL-1β 的表达，结果显示，50 μM 和100 μM 谷氨酸处理组，IL-1β 蛋白的表达明显升高，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

3 讨论

星形胶质细胞参与神经退行性疾病、精神性疾病的复杂病理机制。神经元和星形胶质细胞通过调节神经递质谷氨酸/谷氨酰胺循环来维持中枢神经系统神经传递的平衡［4］。星形胶质细胞能够调节谷氨酸和离子稳态、胆固醇和鞘脂代谢，并对环境因素刺激做出反应，以上都是与神经系统疾病有关［10］。谷氨酸是中枢神经系统中兴奋性神经元释放的最普遍的神经递质之一；然而，细胞外空间中残留的谷氨酸具有潜在的神经毒性，突触和突触外谷氨酸的过量导致神经元过度兴奋和神经元死亡，这一过程被称为“谷氨酸兴奋毒性”［11］。正常情况下，谷氨酸在神经细胞内的浓度很高，然而，在细胞外液中却保持很低的水平约为3～4 µM［12-13］。因为在星形胶质细胞存在清除过量谷氨酸的转运蛋白，可将中枢神经系统中90%的过量谷氨酸清除和转运［14-15］。目前尚不清楚细胞外高浓度谷氨酸是否能刺激星形胶质细胞发生炎症反应？为了阐明这些现象，在本研究中，笔者用不同浓度的谷氨酸（0 μM、25 μM、50 μM、100 μM）刺激星形胶质细胞24 h。结果发现，与0 μM 组相比，100 μM 谷氨酸处理组GFAP 蛋白表达明显升高，50 μM 和100 μM 谷氨酸处理组IL-1β蛋白水平明显提高，这说明星形胶质细胞在转运过量谷氨酸的过程中被激活，炎症因子的释放可能促进谷氨酸在细胞间隙的进一步释放［16］，促炎因子水平增加，也会导致星形胶质细胞转运谷氨酸的能力下降，从而形成炎症反应和谷氨酸兴奋性毒性增加的恶性循环。然而，在高浓度谷氨酸的内部环境中，星形胶质细胞是否发生了其他变化，还需要进一步的整体动物水平的实验验证。

综上所述，本实验研究证实了高水平的细胞外谷氨酸可以诱导星形胶质细胞激活并释放促炎细胞因子。本研究将为拮抗谷氨酸的兴奋性毒性提供实验依据。