一种改善磁微粒化学发光项目CA72-4产品性能的方法

陈永奇，逯阵毫，马明，李静雯，王玉堂

（郑州安图生物工程股份有限公司，河南 郑州 450016）

癌症抗原72-4（CA72-4）法是一种检测肿瘤相关糖蛋白72（TAG-72）的免疫分析法，该抗原被发现是在某些肿瘤细胞群中表达的抗原［1-3］。抗原被鉴定为220～400 kDa 黏蛋白型糖蛋白［1,4］。抗体B72.3 最初是用转移到肝脏的乳腺肿瘤的膜富集细胞提取物制备的，并已被证明能与TAG-72［3］反应。CC49 是TAG-72 特异性抗体。CC49 抗体和B72.3 抗体分别识别TAG-72 的Galβ（1-3）唾液酸-tn和唾液酸-tn 糖链表位［5-6］。有趣的是，CA72-4 在恶性胃癌、卵巢癌、结直肠癌和胰腺癌患者的血清或血浆中含量升高，并被用于监测胃肠道和黏液性卵巢癌患者［1,7-9］。血液测试可以为临床医生提供各种疾病迹象的信息。由于血液检测的结果提高了诊断的准确性，诊断测定显示准确的测量值对于临床决策至关重要。直到20 世纪40 年代，标本都是用肉眼和人工检测的。每次测试都很耗时，测试的准确性取决于技术人员的技能水平。20 世纪50 年代，随着美国制造商自动分析仪的出现，全面的检测自动化开始了。自动化技术的进步缓解了准确性和速度的问题。如今，全国医疗机构（医院和临床检验中心）的实验室都有相当数量的标本，并在24 h 内进行检测。免疫化学方法在医学实验室中被常规使用。电化学发光免疫分析（ECLIA）法和化学发光免疫分析（CLIA）法因其灵敏度高、背景低、操作简单而广泛应用于自动化分析仪中。然而，这两种方法都受限于免疫化学反应对各种干扰的敏感性，如血清中的自体抗体、抗动物IgG 的嗜异抗体、交叉反应、溶血、高脂血症和高胆红素血症。本文基于化学发光免疫分析法，采用一些手段排除交叉反应等干扰，提高检测准确性。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 主要试剂 小牛血清白蛋白（BSA）（Sigma公司，雅为生物公司等），鱼明胶（Sigma 公司）磁微粒（Merck 公司，羧基磁珠，100 mg/mL）；包被抗体（郑州伊美诺生物技术有限公司）；酶标抗体（郑州伊美诺生物技术有限公司）；1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐 EDC（Sigma 公司）；N-羟基丁二酰亚胺 NHS（Sigma 公司）；磁微粒偶连缓冲液0.1 mol/L pH=7.4 MES buffer；磁微粒稳定液：缓冲液0.1 mol/L pH=7.4 PBS buffer；酶结合物稳定液：缓冲液0.1 mol/L pH=7.4 PBS buffer；乙醇胺（Aladdin 公司）；高碘酸钠（Sigma公司）；氰基硼氢化钠（Sigma 公司）；精氨酸（Sigma 公司）。

1.1.2 主要仪器 全自动化学发光测定仪AutoLumo A2000 Plus（安图生物）；电热恒温培养箱（上海跃进医疗器材有限公司）；振荡器（TOPSCIEN 公司）。

1.2 研究方法

1.2.1 磁微粒试剂包被方法 在4 mL 玻璃瓶中分别加入0.1 mL 10%质量浓度羧基磁珠，1 mL 偶连缓冲液，震荡5 min 后磁分离，将上述操作重复3 遍进行清洗，而后分别加入0.3 mL 0.1 mol/L EDC 溶液与0.3 mL 0.1 mol/LNHS 溶液（注：以偶连缓冲液进行溶解），室温震荡反应1 h；洗2 次后加入0.9 mL 磁微粒偶联缓冲液和0.6 mg CA72-4抗体，并室温震荡反应2 h。最后加入乙醇胺60 μL 继续反应30 min，使用磁微粒稳定液（根据不同方案，向磁微粒缓冲液中加入不同的稳定剂，稳定剂浓度为10 mg/mL），磁分离清洗3 次后定容至9 mL，2～8 ℃储存。

1.2.2 酶结合物配制方法 配制酶结合物稳定液，根据不同方案，向从酶结合物缓冲液中加入不同的稳定剂，稳定剂浓度为10 mg/mL；再向上述配置好的稳定液中加入酶结合物，终浓度为1 μg/mL。充分混匀，2～8 ℃储存。

1.2.3 测试模式 由机器按照上机文件进行测试，每次加入50 μL 校准品（浓度值为0 μIU/mL、5 μIU/mL、50 μIU/mL、100 μIU/mL、150 μIU/mL、300 μIU/mL）、20 μL 磁珠混悬液和100 μL 酶结合物以及100 μL 底物。具体过程使用A2000plus 仪器进行检测，除磁珠混悬液其余均使用该公司在售试剂盒内组分。

1.2.4 检测指标 稳定性指标：目前IVD 行业对化学发光试剂盒的稳定性的共识为在37 ℃下放置7 d 约等于试剂条件下在2～8 ℃存放8～12 个月，计算浓度点相对光单位（RLU）下降率ROD（%）=ABS（RLU37℃7d/RLU2～8℃-1）×100%，ROD 均 值为校准品各值的平均值，目前业内公认ROD 值小于10%为合格标准。

1.2.5 BSA 去糖基化方法 将BSA 用纯化水配成50 mg/mL，充分搅拌，待其完全溶解后，向其中加入高碘酸钠和精氨酸，高碘酸钠及精氨酸的终浓度均为5 mg/mL，避光反应3 h。向其中加入氰基硼氢化钠，终浓度为5 mg/mL，过夜反应。用PBS 缓冲液透析，过夜，透析液：PBS 缓冲液液＞1∶50。

2 结果

2.1 不同稳定剂对产品性能影响的结果

将鱼明胶、BSA 加入稳定液（10 mg/mL）中，上机验证产品CA72-4 反应性，结果如表1 所示。

表1 不同稳定剂对产品性能影响的结果比较

2.2 不同厂家BSA 对产品性能影响的结果

将不同厂家BSA 加入到稳定液中（10 mg/mL），上机验证产品CA72-4 反应性，结果如表2 所示。

表2 不同厂家BSA 对产品性能影响的结果

2.3 去糖基化BSA 对产品性能影响的结果

将上述提到效价较优的BSA 进行去糖基化，加入到稳定液中，且对该产品进行稳定性考核，其结果如表3 所示。

表3 去糖基化BSA 对产品性能影响的结果

通过表2 和表3 数据进行对比，将BSA 去糖基化之后，本底有所降低，高浓度RLU 略微降低，但是泽龙20190739 批号的BSA 出现异常。除此之外，其它进行7D 热加速稳定性考核，仅个别去糖基化BSA 作为稳定剂本底会升高，其它均较优。满足项目需求。

3 讨论

本文通过筛选常用的两种稳定剂，确定BSA对RLU 影响较小，但是本底高。后期，笔者又对不同厂家的BSA 进行筛选，发现不同厂家BSA 对产品性能影响差异较大，综合分析，可能是BSA上的糖基于抗体发生了交叉反应，因此本文对BSA 进行去糖基化，最终通过热加速稳定性考核，本底降低，满足项目需求。