微小RNA-127-3p对乳头状甲状腺癌细胞增殖、侵袭及迁移的影响

吴文金, 刘 洋, 王济国, 钟安娜

[宝安中医院(集团), 1.检验科, 2.肿瘤科, 广东 深圳, 518133;3. 广东省深圳市宝安区妇幼保健院, 广东 深圳, 518133]

尽管多数乳头状甲状腺癌患者经过综合治疗后预后良好,但仍有部分患者出现远处转移。微小RNA在肿瘤复发中扮演着重要角色[1-2]。研究[3]表明,宫颈癌组织微小RNA-127-3p(miR-127-3p)表达降低,可抑制宫颈癌细胞恶性生物学行为。miR-127-3p过表达可抑制黑色素瘤细胞的增殖、侵袭及转移,诱导肿瘤细胞凋亡[4]。但miR-127-3p与甲状腺癌恶性表型的关系无文献报告。肿瘤细胞侵袭抑制因子(SCAI)在肿瘤组织中异常表达,参与调控肿瘤的恶性表型[5-7], 但SCAI与乳头状甲状腺癌的关系尚不清楚。研究[7-8]显示, SCAI与多种微小RNA存在靶向关系,参与调控肿瘤的恶性表型。但miR-127-3p与SCAI的关系未知。本研究分析miR-127-3p对乳头状甲状腺癌恶性表型的影响及其作用机制。

1 材料与方法

1.1 主要试剂、细胞株及仪器

选取乳头状甲状腺癌细胞TPC1、正常人甲状腺细胞Nthy-ori 3-1(本实验保存)。主要试剂和仪器主要包括: 引物、miR-127-3p 过表达载体(mimics)、miR-NC(miR-127-3p过表达的空载体)、对照质粒、si-NC、si-SCAI、突变型(MUT)-SCAI、野生型(WT)-SCAI(广州云舟生物科技股份有限公司); 鼠抗人SCAI、β-actin、羊抗鼠二抗(沈阳万类康生物有限公司); RNA提取、聚合酶链反应(PCR)试剂盒,转染试剂盒(广州云舟生物科技股份有限公司); 氯化丙定(PI)(广州云舟生物科技股份有限公司); 荧光素酶检测试剂盒(大连医友生物有限公司); 噻唑蓝(MTT, 大连医友生物有限公司); Transwell小室(Corning,美国); 酶标仪(杭州奥盛仪器有限公司); PCR仪(杭州奥盛仪器有限公司)。

1.2 细胞培养、转染及分组

利用完全DMEM培养基培养细胞,培养箱条件设置为37 ℃、5%CO2, 隔日传代、换液。取生长良好的TPC1细胞,将质粒及Lip 2000一起加入到细胞培养基中进行转染,分为空白组(NC组,无处理)、miR-NC组(转染miR-127-3p过表达的空载体)、miR-127-3p组(转染miR-127-3p-mimics)、si-NC组(转染 SCAI 敲低空载体)和si-SCAI组(转染si-SCAI)。

1.3 实时荧光定量PCR检测miR-127-3p、SCAI mRNA水平

取对数生长期的细胞,利用Trizol提取总RNA, 检测浓度,逆转录cDNA: 10 mmol/L dNTP1.5 μL, 5×PCR buffer 5 μL, 反转录酶1 μL, DEPC水2.5 μL, 总体积25 μL。然后采用PCR扩增,引物序列见表1。反应体系: SYBR® Premix Ex TaqTM(2×)12.5 μL+上下游引物(10 μmol/L) 1 μL, 加DEPC水,总体积为25 μL。反应参数: 95 ℃ 1 min、90 ℃ 20 s、50 ℃ 15 s, 共40个循环。2-△△Ct法表示表达量。内参为U6、GAPDH。所有实验均重复3次。

表1 目标引物序列

1.4 MTT实验

将细胞接种于96孔板,培养箱继续培养,分别于0、48、72、96 h检测细胞活力,检测前加入20 μL MTT, 培养4 h, 然后加入150 μL DMSO, 水平摇床摇动30 min,上机检测光密度(OD)值。每组5个复孔。

1.5 Transwell小室实验

迁移实验: 上室中加入1×105个细胞,用无血清培养基配制,下室加入含20%血清培养基, 48 h后去除上室未穿细胞,用4%多聚甲醛固定, 0.1%结晶紫染色,洗涤,计数。侵袭实验: 首先用DMEM培养基按照1∶8稀释基质胶,上室中加40 μL基质胶,其余同上。所有实验均重复3次。

1.6 Western blot法检测SCAI蛋白的表达

去除培养基,加入裂解液提取总蛋白。配制3%胶,点样, SDS-PAGE电泳2 h将蛋白转移至膜上, 5%脱脂奶粉封闭1 h, 加入SCAI(1∶1 000)、β-actin(1∶1 000)抗体冰箱过夜,次日加入二抗(1∶1 000), 室温1 h, 洗涤3次后上机曝光, Image J软件分析光密度。所有实验均重复3次。

1.7 荧光素酶实验验证miR-127-3p与SCAI的靶向关系

分别将MUT-SCAI、WT-SCAI质粒分别转入NC组和miR-127-3p组, 48 h后检测各组细胞荧光活性。所有实验均重复3次。

1.8 统计学方法

2 结 果

2.1 乳头状甲状腺癌细胞、正常人甲状腺细胞中的miR-127-3p表达

TPC1细胞中的miR-127-3p表达水平低于Nthy-ori 3-1细胞,差异有统计学意义(P<0.01)。见图1。

与TPC1细胞比较,∗∗P<0.01。图1 各组细胞中miR-127-3p的表达

2.2 乳头状甲状腺癌细胞及正常甲状腺细胞中SCAI蛋白、SCAI mRNA表达

TPC1细胞中SCAI蛋白、SCAImRNA表达均低于Nthy-ori 3-1细胞,差异有统计学意义(P<0.01)。见图2。

2.3 miR-127-3p过表达对TPC1细胞增殖、迁移和侵袭的影响

miR-127-3p组细胞中的miR-127-3p表达水平高于NC组、miR-NC组,差异有统计学意义(P<0.05), 但NC组、miR-NC组的表达水平差异无统计学意义(P>0.05)。miR-127-3p组48、72 h 细胞OD值、迁移和侵袭细胞数量低于NC组、miR-NC组,差异有统计学意义(P<0.05); NC组、miR-NC组的细胞活力、细胞迁移和细胞侵袭数量比较,差异无统计学意义(P>0.05)。见图3。

A: Western blot检测SCAI蛋白; B: 各组SCAI蛋白表达水平; C: 各组SCAI mRNA表达水平。与TPC1细胞比较, ∗∗P<0.01。图2 TPC1细胞和Nthy-ori 3-1细胞中SCAI蛋白、SCAI mRNA的表达

2.4 抑制SCAI表达对TPC1细胞增殖、迁移和侵袭的影响

si-SCAI组细胞中SCAI蛋白及SCAImRNA水平低于NC组、si-NC 组,差异有统计学意义(P<0.05), 但NC组、miR-NC组细胞中SCAI蛋白及SCAImRNA水平比较,差异无统计学意义(P>0.05)。si-SCAI组48、72 h细胞OD值、迁移和侵袭细胞数量高于NC组、si-NC组,差异有统计学意义(P<0.05)。见图4。

A: 各组miR-127-3p表达水平; B: MTT结果; C: 迁移实验及侵袭实验。与miR-127-3p组比较, ∗P<0.05。图3 miR-127-3p过表达对TPC1细胞增殖、迁移和侵袭的影响

2.5 各组细胞SCAI蛋白表达

miR-127-3p组SCAI蛋白表达水平高于NC组、miR-NC组,差异有统计学意义(P<0.05)。见图5。

A: Western blot检测SCAI蛋白; B: 各组SCAI蛋白水平。与miR-127-3p组比较, ∗P<0.05。图5 各组细胞SCAI蛋白表达水平

2.6 miR-127-3p与SCAI的靶向关系

生物信息分析显示, miR-127-3p与SCAI存在互补碱基。转载WT-SCAI的 miR-127-3p组细胞荧光素酶活性高于转载WT-SCAI的NC组细胞,差异有统计学意义(P<0.05)。见图6。

A 互补碱基对; B荧光素酶实验。与NC组比较, ∗P<0.05。图6 miR-127-3p与SCAI的靶向关系

3 讨 论

大量文献[9-12]报道,微小RNA在乳头状甲状腺癌进展中发挥重要作用。miR-127-3p在多种肿瘤组织中高表达。研究[13]表明,下调miR-127-3p能抑制肝癌进展。miR-127-3p可抑制黑色素瘤细胞的恶性行为,促进凋亡[14]。研究[15]发现,卵巢癌患者血清miR-127-3p与临床病理特征有关。本研究结果显示,乳头状甲状腺癌细胞中miR-127-3p呈低表达,提示miR-127-3p可能是乳头状甲状腺癌的抑癌基因。为了进一步研究miR-127-3p在乳头状甲状腺癌发生、发展中的作用,本研究构建了miR-127-3p过表达乳头状甲状腺癌细胞,并分析了其对肿瘤细胞恶性表型的影响。结果显示, miR-127-3p过表达的细胞增殖、侵袭及迁移能力显著降低。研究[16-20]发现, miR-127在前列腺癌、膀胱癌及结肠癌组织中呈低表达,机制可能是miR-127启动子区域的异常甲基化,通过去甲基化药物激活miR-127表达,并抑制其靶标 B细胞淋巴瘤细胞6(Bcl-6)抑制肿瘤发生。

miR-127-3p靶向多个基因行使其功能,如miR-127-3p可通过靶向MAPK4抑制卵巢癌肿瘤的生长[21]。另外, miR-127-3p可通过Wnt/β-catenin信号通路抑制肿瘤细胞的增殖[22]。SCAI是一种抑癌基因,参与肿瘤细胞的恶性生物学行为。另外,在多种肿瘤中SCAI可被多种微小RNA抑制[23-24]。本研究结果显示,乳头状甲状腺癌细胞中SCAI呈高表达,抑制SCAI后增强了细胞恶性生物学行为,提示SCAI与肿瘤进展有关。许娟秀等[25]研究发现, miR-135a可靶向SCAI抑制宫颈癌糖酵解。研究[26]发现,在肝癌细胞中SCAI可作为miR-425-5p的靶基因,当其被miR-425-5p抑制后可以促进肝癌细胞的上皮间质转化(EMT)和转移。上述结果证实,miR-127-3p通过负向调控SCAI的表达抑制甲状腺癌细胞的增殖、侵袭及迁移。

综上所述,乳头状甲状腺癌中miR-127-3p呈低表达,可抑制细胞恶性生物学行为,机制可能与靶向SCAI有关,但具体机制有待进一步探讨。