伊布替尼介导心房颤动机制的研究进展

刘梦蝶 陈延军

伊布替尼(ibrutinib)是一种高效的口服小分子布鲁顿酪氨酸激酶(Bruton’s tyrosine kinase,BTK)抑制剂,在临床上已被证实对B细胞淋巴瘤有显著疗效,2014年被美国食品和药物管理局(FDA)批准作为复发性及难治性慢性淋巴细胞白血病(chronic lymphocytic leukemia,CLL)患者的一线用药。在随机对照研究(RESONATE-2)Ⅲ期临床试验中,伊布替尼的5年无进展生存期为70%和5年总生存期为83%。但近年来发现,长期服用伊布替尼治疗的患者心房颤动(简称“房颤”)的发生率显著提高(4%～16%)。这为伊布替尼在临床中的应用和发展带来了前所未有的挑战。目前,关于伊布替尼相关性房颤的分子机制研究甚多,但尚未得出明确结论。本文总结了以往对伊布替尼诱导房颤机制的相关研究,阐述了非心肌细胞在酪氨酸激酶抑制剂引发心脏毒性中的重要作用。由此我们提出,伊布替尼通过影响非心肌细胞的旁分泌功能,导致炎症因子和细胞介质释放,激活氧化应激信号通路,干扰心肌细胞和非心肌细胞之间的相互作用,从而引发心血管不良事件。这为我们探索该领域提出了新的研究思路。

1 伊布替尼的“脱靶”效应

伊布替尼是首个BTK共价不可逆抑制剂,BTK是B细胞受体信号通路上的重要组成部分,BTK的激活可调控信号通路的下游,控制细胞的增殖、生存和迁移活动[1]。BTK在CLL中过度表达或激活,会引起肿瘤细胞的增殖。伊布替尼能够与BTK活性位点上的半胱氨酸残基(Cys-481)不可逆地共价结合,从而抑制BTK阻断B细胞受体信号通路的传导,改变肿瘤微环境,抑制肿瘤B细胞的恶性增殖并诱导其凋亡,达到良好的抗肿瘤效果[2]。但研究发现,伊布替尼不仅仅作用于心脏组织中的BTK,也可与C-Src酪氨酸激酶(C-Src tyrosine kinase,CSK)、酪氨酸蛋白激酶Fyn、受体相互作用蛋白激酶3(receptor-interacting protein kinase 3,RIP3)、MEK5等蛋白激酶进行可逆性结合,产生“脱靶”效应,从而导致心肌电生理和心脏结构的改变。非靶向抑制目前被认为是伊布替尼诱导房颤发生的主要机制。

2 伊布替尼与房颤发生

自伊布替尼上市以来,研究者们通过大量的回顾性及前瞻性研究发现,长期口服伊布替尼治疗的患者,房颤的发生率升高[3-6]。在伊布替尼治疗初发型和复发型CLL的RESONATE-2和RESONATE的Ⅲ期试验中,分别有28%和12%的患者因其毒性而停药,其中房颤的发生率分别为16%和11%[7]。Thompson等[8]研究发现,在服用伊布替尼3～6个月后,5%～9%的CLL患者发生房颤。Wiczer等[9]研究发现,在582例接受伊布替尼治疗的患者中,有76例发生房颤,6个月、1年和2年的累积发病率为5.9%、7.5%和10.3%。Baptiste等[10]采用多中心前瞻性研究方法,观察随访53例伊布替尼治疗的CLL患者,发现伊布替尼相关性房颤的2年发病率为38%,是未使用伊布替尼人群的15倍。同样,Ganatra等[11]对2 166例伊布替尼治疗的患者随访18个月发现,有190例患者发生了房颤,发病率为8.15%。目前,已证实长期接受伊布替尼治疗可增加患者房颤的发生率,且房颤与心力衰竭和血栓栓塞密切相关。伊布替尼相关性房颤常常是患者停药的重要因素,因此,明确伊布替尼诱导房颤发生的主要机制,制定预防策略是目前面临的重大挑战。近年来,第二代高选择性的BTK抑制剂接连问世,包括阿卡替尼、泽布替尼等,在目前的临床随机试验中,虽尚未有严重的药物相关性房颤的报道,但此类药物的疗效还有待观察和考量。

3 伊布替尼诱导房颤发生的机制

3.1 磷脂酰肌醇3激酶-蛋白激酶B(phosphatidylinositol 3 kinase-protein kinase B,PI3K-Akt)信号通路

近年来,科学家通过体内和体外实验在细胞与分子水平上对伊布替尼诱导房颤的机制进行了大量的探索。Essa等[5]曾提出,房颤发生可能与伊布替尼直接抑制在心脏组织中大量表达的BTK有关。然而,近期研究发现TEC(Tec protein tyrosine kinase)也在人类心脏组织中表达,且在心房组织中的表达量最高,McMullen等[12]提出伊布替尼除对心脏组织中BTK的靶向抑制作用外,对TEC也有靶外抑制作用,引起“脱靶”效应。PI3K-Akt信号通路是应激条件下心脏保护的关键调节因子,并且受BTK和TEC的共同调控[13]。伊布替尼可能通过抑制BTK及TEC的表达,阻断PI3K-Akt下游信号通路,从而增加心律失常的易感性。长期伊布替尼作用可抑制PI3K蛋白的表达,增加Na+内流强度,延长动作电位的持续时间,从而增加房颤的易感性(图1)。越来越多的研究证实,PI3K在细胞存活、增殖、肥大和心律失常方面起关键作用[14]。Wiczer等[9]也曾提出,心肌细胞BTK的调节可能与PI3K-Akt通路活性降低有关,但PI3K功能低下与房颤之间的关系尚不明确[11]。

Ibrutinib：伊布替尼;NOX2/4：NADPH氧化酶;ROS：活性氧;CaMKⅡ：钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ;SR：肌质网;RyR2：2型兰尼碱受体;Ca2+ overload：钙超载;DADs：延迟后除极;AF：心房颤动;TGF-β：转化生长因子β;Fibrosis：纤维化;CSK：C-Src酪氨酸激酶;SFK：Src家族酪氨酸激酶;Inflamation：炎症;PI3K：磷脂酰肌醇3激酶;Akt：蛋白激酶B;K+：钾离子;Na+：钠离子;Ca2+：钙离子图1 伊布替尼诱导房颤发生的机制

Antigen：抗原;B cell antigen receptor：B细胞抗原受体;CSK activation：C-Src酪氨酸激酶激活;SFK：Src家族酪氨酸激酶;C-terminal phosphorylation：羧基末端磷酸化;inactivity：失活;differentiation：分化;proliferation：增殖;migration：迁移;Ibrutinib：伊布替尼;activity：活化;inflammation：炎症图2 伊布替尼作用于心肌细胞的CSK-SFK信号通路

3.2 活性氧与钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ(Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase Ⅱ,CaMKⅡ)信号通路

近年研究发现,增强CaMKⅡ的活性可能是伊布替尼诱导心脏毒性的原因之一[15-16],CaMKⅡ是一种生物学标志物,它可将活性氧的增加与房颤联系起来。研究发现伊布替尼可增加活性氧的产生,激活氧化型CaMKⅡ,从而增加房颤的易感性。Yang等[15]研究发现,长期暴露于伊布替尼的小鼠活性氧相关蛋白的表达增加,使CaMKⅡ中蛋氨酸(Met281/282)氧化,增加2型兰尼碱受体(ryanodine receptor type 2,RyR2)上丝氨酸(Ser2814)的磷酸化,导致钙稳态失衡,后除极增强,引发心脏的电重构。另外,活性氧的激活增加了转化生长因子β的表达,引起小鼠的心房纤维化,导致心房的结构重构,影响细胞间的电传导(图1)。由此他们猜测,通过抑制活性氧的产生,阻断CaMKⅡ-RyR2通路,可以预防伊布替尼相关性房颤的发生。

3.3 CSK-Src家族酪氨酸激酶(Src-family tyrosine kinase,SFK)信号通路

伊布替尼不仅可抑制BTK,还可抑制其他激酶。在最新研究中发现,非BTK靶点在伊布替尼诱导房颤中起一定作用[17-18],伊布替尼在治疗小鼠4周后导致心房纤维化及大量炎症因子产生,从而诱导房颤发生。在BTK缺乏的小鼠上,得到了相同的结果。这表明“脱靶效应”是伊布替尼诱导房颤的主要机制。他们通过蛋白质组学分析确定,CSK可能是伊布替尼诱导房颤的心脏特异性靶点。CSK是SFK的内源性“抑制剂”,CSK激活可使SFK的羧基末端磷酸化,导致SFK失活,后者主要参与细胞的增殖、分化、粘附和炎症反应等。CSK在人类心脏组织中心房的表达水平高于心室。实验发现,在心脏特异性敲除CSK基因的小鼠模型中重现了伊布替尼治疗小鼠的心脏表型。最终,研究者认为长期使用伊布替尼可抑制CSK将SFK羧基末端磷酸化,导致SFK活性增强,引起心房的纤维化及炎症反应的激活,从而增加房颤的易感性(图1、2)。上述研究表明,CSK是伊布替尼介导房颤的主要靶点。

3.4 心肌电重构

研究发现,心肌电重构是促心律失常的重要途径[19-20]。以往研究认为,蛋白质酪氨酸激酶抑制剂对兔心肌细胞中的钠电流有重要影响,并且相关实验也证实了钠电流的改变在蛋白质酪氨酸激酶信号通路中发挥重要作用[21]。同样,心肌细胞中钙调节失衡也会诱导心肌电重构,在伊布替尼治疗4周的小鼠模型中,发现心肌细胞内钙离子失衡会引发舒张期自发性钙释放,增加动作电位的延迟后除极,导致心律失常的发生[16,22-23]。JournaloftheAmericanHeartAssociation上最新发表的文章中阐述了伊布替尼相关性房颤与窦房结细胞和心房肌细胞离子通道之间的关系,提出了伊布替尼通过阻断窦房结细胞的快速延迟整流钾离子电流和心房肌细胞的钠电流、瞬时外向钾电流通道,损害窦房结和心房肌细胞的传导,增加房颤的易感性[24](图1)。然而,有研究者提出了与以往不同的观点,认为长期伊布替尼治疗的小鼠不会改变左心房心肌细胞的动作电位和钠电流,并且电重构不是伊布替尼诱导房颤发生的主要原因[21-23]。然而,根据目前的研究结果,更倾向于将心肌电重构作为伊布替尼诱发小鼠房颤的潜在性机制。

3.5 人类多能干细胞(human pluripotent stem cells,hPSC)的应用

小鼠在生理、病理方面不同于人类,未经处理的小鼠很难发生房颤,因此较难构建小鼠房颤模型。hPSC衍生的心肌细胞(hPSC-CMs)是一种新型药物筛选工具,已被用于细胞水平上模拟各种类型心律失常的电紊乱。在Laksman等[25]和Shafaattalab等[26]的研究中,以hPSC衍生的心房肌和心室肌细胞为研究对象,发现伊布替尼可缩短hPSC-CMs动作电位时程,增加钙瞬态持续时间,增强hPSC-CMs的延迟后除极,最终触发房颤。上述研究首次证实了hPSC衍生的心房肌和心室肌细胞的特异性毒性。hPSC-CMs已成为临床前药物筛选和心脏毒性机制研究的重要工具,通过对其衍生出的窦房结细胞、心房肌细胞及心室肌细胞进行研究,可特异性地观察伊布替尼对不同细胞的心肌毒性。

3.6 非心肌细胞与心肌细胞的相互作用

目前,伊布替尼对心肌细胞功能的影响已被广泛研究,但对非心肌细胞的研究少之甚少。在健康的心脏中,除心肌细胞外,还存在其他非心肌细胞共同维持心脏的功能,包括心脏成纤维细胞、内皮细胞、血管平滑肌细胞、免疫细胞和心脏祖细胞等[27-28]。最新研究表明,新型抗肿瘤药物可能通过增强或抑制非心肌细胞上的靶点发挥促心律失常作用[29]。成纤维细胞占非心肌细胞的90%,是心脏内最多的细胞类型,它与心肌细胞之间存在广泛联系。成纤维细胞通过分泌细胞外基质维持心脏结构,并且与心肌细胞共同促进心脏的同步收缩。此外,它可分泌许多化学介质和细胞因子影响心肌细胞的功能[30-31]。有证据表明,在抗肿瘤药物治疗的心脏成纤维细胞中出现活性氧积累和氧化应激增加,这将会导致心脏纤维化和潜在的舒张功能障碍[32-33]。Cho等[34]的实验证实,酪氨酸激酶抑制剂在体外对大鼠成纤维细胞产生显著影响,包括降低细胞活力、增殖和改变成纤维细胞分泌组基因的表达,激活多种促炎基因的关键转录因子。McMullen等[30]用成年大鼠分离出的心脏成纤维细胞进行体外实验,发现经舒尼替尼(一种酪氨酸激酶抑制剂)治疗后,成纤维细胞的表型改变且细胞活性及数量减少。实验表明,舒尼替尼能够增加线粒体超氧化物的生成,氧化磷酸化CaMKⅡ,同时它也增加钙离子释放,诱导细胞的凋亡和坏死,最终引发心脏毒性。该实验首次证实了氧化激活CaMKⅡ信号通路是舒尼替尼在成纤维细胞中作用的潜在机制。并且,酪氨酸激酶抑制剂介导的心脏毒性可通过靶向抑制CaMKⅡ的表达来减少或逆转[30,35]。这些结果表明,心脏成纤维细胞可能是参与病理性心脏形成的重要细胞。

伊布替尼也是酪氨酸激酶抑制剂中的一种,它已被证实在心肌细胞中通过增加活性氧的产生从而激活细胞肌质网中CaMKⅡ-RyR2通路,诱导房颤发生。大量研究表明,非心肌细胞在酪氨酸激抑制剂介导的心脏毒性中有不可或缺的作用,然而目前尚无有关伊布替尼通过影响非心肌细胞从而诱发房颤的报道及研究。由此我们提出猜想,伊布替尼通过影响非心肌细胞的旁分泌作用,产生多种炎症因子和细胞介质,从而干扰心肌细胞和非心肌细胞之间的相互作用,导致心脏毒性的产生。然而,心肌细胞与非心肌细胞之间的作用机制非常复杂,需要进一步研究以了解它们在心脏毒性中的作用,这可能是未来抗肿瘤药物引发心脏毒性研究的主要方向,通过对该领域的研究,可确定介导细胞通讯的分子靶点,供临床制定新的治疗策略,从而减少房颤的发生,提高患者远期预后和疗效。

4 小结与展望

长期伊布替尼治疗增加房颤发生的易感性在临床中已被证实,但伊布替尼对CLL和套细胞淋巴瘤等血液系统疾病的疗效也是显著的,因此尽快找到伊布替尼相关性房颤发生的潜在性机制是众多研究者正在努力的方向。本文从不同角度对最新的房颤机制进行概括和总结,发现伊布替尼的“脱靶效应”是房颤发生的主要机制,非心肌细胞可能在伊布替尼介导心脏毒性中起重要作用,是该领域未来研究的新方向。通过对伊布替尼心脏毒性的探索,确定介导细胞间通讯的分子靶点,制定新的治疗策略,从而早期预防房颤的发生,减少临床心血管不良事件发生率,提高患者的生存率。

利益冲突：无