安徽省部分地区规模兔场球虫分子流行病学调查

李文超, 李加佳, 陈东钱, 李创伟,程启航, 马明宣, 罗昕雨, 李乔乔

(1.安徽科技学院 动物科学学院,安徽 凤阳 233100;2.动物营养调控与健康安徽省重点实验室,安徽 凤阳 233100)

兔球虫病是由多种艾美耳球虫寄生于兔肝脏或肠道引起的一种常见多发的原虫病,严重威胁养兔业的健康发展[1]。传统上,球虫虫种的鉴定主要基于卵囊形态、寄生部位及病变特征等,但不同的虫种在上述指标有重叠,导致这些方法特异性差,费时费力等,因此早期兔球虫的命名较为混乱,至少有25个种被描述及命名。最近,依据多种能精确鉴定不同兔球虫虫种的的分子检测方法,已有15种兔球虫虫种被确定为有效种[1-5]。

大量现场调查显示,兔球虫感染率高达100%,混合感染非常普遍[1,6]。国内多个省份也有兔球虫病流行情况的相关报道,但相关研究多采用传统方法进行虫种鉴别[7-10]。采用分子方法对兔球虫进行调查的研究不多,目前仅见四川省和甘肃省有相关报道[11-12]。近年来,安徽省兔养殖量越来越大,但迄今仅见肥西县有兔球虫感染的相关报道,其余地区尚未报道,这对安徽省兔球虫病的防控非常不利[13]。鉴于此,本研究拟对安徽省多个地区规模兔场球虫感染情况进行分子流行病学调查,以期为安徽省兔球虫病防控提供参考。

1 材料与方法

1.1 样品采集

2020年6—9月,分别从亳州市利辛县、蚌埠市怀远县、六安市裕安区、黄山市歙县、淮南市凤台县和安庆市宿松县等地区的6个规模兔场,收集新鲜兔粪样418份,分别装进洁净自封袋中,编号、标明采集地等信息后,置于4 ℃冰箱待检。上述兔场均饲喂添加抗球虫药物的商品全价料,且从未使用过任何兔球虫疫苗产品。

1.2 主要仪器和试剂

T100型梯度PCR仪(伯乐生命医学产品(上海)有限公司);Tan2500R凝胶图像处理系统(上海天能科技有限公司);粪便基因组DNA提取试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司)。

1.3 基因组DNA的提取

按照试剂盒说明书提取粪便基因组DNA,所提取的DNA于-20 ℃保存,用于后续PCR扩增。

1.4 PCR扩增

11种艾美耳球虫ITS1基因的引物参照Oliveira等[2]的方法进行(表1),委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 PCR引物及条件

2轮PCR反应体系体积均为25 μL,含0.25 μL 5 U/μL rTaq酶,2 μL 1.25 mmo/L dNTP,2.5 μL 10×PCR缓冲液,各0.3 μL 20 mol/L上、下游引物,1 μL模板,18.65 μL双蒸水。2轮PCR反应参数一致,均为94 ℃预变性 2 min;94 ℃变性60 s,56 ℃退火 60 s,72 ℃ 延伸60 s,共35个循环;最后72 ℃ 延伸10 min。

1.5 测序及分析

每种球虫随机选取2个阳性PCR产物送生工生物工程(上海)股份有限公司进行双向测序。所得序列经Dnaman 9.0软件比对和加工,在GenBank中进行Blast搜索,验证其是否为相应兔艾美耳球虫ITS1序列。

2 结果与分析

2.1 兔球虫ITS1基因扩增及序列分析

418份样本共扩增出19份中型艾美耳球虫(Eimeriamedia,E.media)、3份盲肠艾美耳球虫(Eimeriacoecicola,E.coecicola)、16份大型艾美耳球虫(Eimeriamagna,E.magna)、12份肠艾美耳球虫(Eimeriaintestinalis,E.intestinalis)、2份小型艾美耳球虫(Eimeriaexigua,E.exigua)、18份穿孔艾美耳球虫(Eimeriaperforans,E.perforans)、14份维氏艾美耳球虫(Eimeriavejdovskyi,E.vejdovskyi)和15份斯氏艾美耳球虫(Eimeriastiedai,E.stiedai)阳性样本,扩增产物大小均符合预期(图1,仅显示E.intestinalis和E.media部分PCR扩增结果)。每种球虫随机选取2个阳性PCR产物进行测序,序列经加工后进行Blast分析,均显示为相应兔球虫ITS1基因。

图1 部分兔球虫ITS1基因PCR扩增结果Fig.1 Partial PCR amplication of ITS1 gene in Eimeria spp. in rabbits注:M为DNA标准DL2000;1～4为部分样本;A为E. intestinalis;B为E. media。

2.2 安徽省兔球虫感染情况

本调查显示,418份样本中共检测出99份兔艾美耳球虫阳性样品,感染率为23.98%,且本调查的所有兔场均有球虫感染,场感染率为100%,不同兔场球虫感染率在8.20%～41.27%。共检出8种兔球虫虫种,其中E.media感染率最高(4.55%),E.exigua感染率最低(仅0.48%),未检出黄艾美耳球虫(Eimeriaflauescens,E.flauescens)、无残艾美耳球虫(Eimeriairresidua,E.irresidua)和梨形艾美耳球虫(Eimeriapiriformis,E.piriformis)。其中,歙县兔场检出6种球虫,宿松县、利辛县和裕安区兔场各检出5种球虫,凤台兔场检出4种球虫,怀远兔场检出3种球虫。E.media、E.magna和E.vejdovskyi在5个兔场均有检出,E.perforans在4个兔场均有检出,E.stiedai和E.intestinalis在3个兔场均有检出,E.coecicola和E.exigua在2个兔场均有检出(表2)。混合感染较为普遍,以二重感染和三重感染为主。

表2 安徽省兔艾美耳球虫感染情况

3 结论与讨论

兔球虫病是严重危害家兔的肠道原虫病之一,1～4月龄的幼兔感染率为100.00%,死亡率高达60.00%～90.00%,严重危害养兔业的健康发展[1]。目前,兔球虫病尚无疫苗可用,主要依靠抗球虫药物治疗以及加强卫生管理等措施进行预防。因此,定期对兔球虫感染情况进行流行病学调查,是生产中做好兔球虫病防控的前提和基础。本研究利用兔艾美耳球虫ITS1基因特异的巢式PCR方法对安徽省部分地区兔场11种球虫感染情况进行调查,可为安徽省兔球虫病防控提供参考。

本研究中,安徽省部分地区兔场艾美耳球虫感染率为23.98%,这一结果低于用传统方法调查所得的四川省(56.40%)、河南省(64.11%)、新疆维吾尔自治区(100.00%)和安徽省肥西县(100.00%)兔球虫的流行率,同时也低于用分子方法调查所得的甘肃省(50.00%)和四川省(71.11%)兔球虫的流行率[10-15]。研究显示球虫感染情况与采样地区、采样季节,养殖方式以及兔子的品种、年龄等多种因素相关,本次调查感染率较低可能与本次调查的均为规模较大的养兔场、饲养管理较为规范、平时注重球虫病的预防有关[12,15]。此外,尽管本调查的6个兔场饲养管理均较好,且都饲喂添加抗球虫药物的商品全价料,但所有兔场均检出有球虫感染,显示上述兔场可能存在较为广泛的耐药球虫虫株,用常规添加抗球虫药物剂量的饲料并不能完全控制球虫在兔群中的流行。

多个研究显示,国内不同地区流行的兔球虫优势虫种不同,如甘肃省兔艾美耳球虫的优势虫种为大型艾美耳球虫、维氏艾美耳球虫和穿孔艾美耳球虫,四川省规模兔场感染的球虫优势种为巨型艾美耳球虫、中型艾美耳球虫和黄艾美耳球虫等[11-12]。本调查发现,安徽省兔场中共检出8种球虫虫种,其中中型艾美耳球虫(4.55%)、穿孔艾美耳球虫(4.31%)、大型艾美耳球虫(3.83%)、斯氏艾美耳球虫(3.59%)、维氏艾美耳球虫(3.35%)的检出率相对较高,提示养殖场要注意这些虫种的防控。此外,本调查未检出黄艾美耳球虫、无残艾美耳球虫和梨形艾美耳球虫,与甘肃省的报道类似,但报道显示黄艾美耳球虫是四川省兔场流行的优势虫种之一,且无残艾美耳球虫在该省兔场流行率也高达60.00%,这些差异可能与不同地区的地理环境、气候、养殖场饲养管理等有一定关系,尚需要做进一步研究[11-12]。

综上,本研究显示安徽省多地兔场球虫感染较为普遍,且检出8种球虫虫种,提示上述兔场要高度重视兔球虫的防控。