基于固态13C NMR 的泥炭土腐植酸存在的证据

Patrick G. Hatcher Derek C. Waggoner Hongmei Chen 著

张 潞2 黄心如2 王笑晗2 陈贤淑2 赵红艳2* 译

1 美国欧道明大学化学与生物化学系 弗吉尼亚州 23529

2 东北师范大学地理科学学院 长春 130024

长期以来普遍认为腐殖质是土壤有机质（SOM）的主要成分，占土壤有机质的50%或以上，占全球大气和海洋中总碳的两倍以上。腐植酸，被定义为SOM 的碱溶、酸不溶成分，连同酸溶和碱溶的黄腐酸以及碱不溶的腐黑物，代表SOM 中被认为是来源于植物、在氧化环境中经历了生物和非生物降解和/或二次合成的那部分物质。最近，一些人试图驳回这一长期存在、经过几十年研究认可的概念，并提出一个新观点，完全挑战腐殖质的存在，推测SOM 由小分子组成，主要是因为它们被包裹在土壤中的矿物质中（Schmidt 等，2011；Kleber 等，2015；Lehmann 和Kleber，2015）。这个新假设的核心，在很大程度上未经证实，这个被称为土壤连续体模型（SCM）的新观点，认为没有证据表明植物降解后的二次合成形成腐殖化的有机质，所有植物生物聚合物成分（碳水化合物、蛋白质、木质素、单宁和脂质）以总体上相同的速度降解为小分子（Lehmann 和Kleber，2015）。从SOM 中提取的腐殖质，特别是腐植酸，被认为是碱性条件下产生的人工制品，它们在SOM 中并不存在。

Lehmann 和Kleber（2015）声称多维溶液核磁共振（NMR）研究（Kelleher 和Simpson，2006）证明腐植酸主要由植物来源的生物聚合物的小分子组合而成，没有证据表明是通过二次合成形成的复杂分子。虽然我们同意腐殖质是小分子（＜1000 Da）的集合体，但我们不能接受二次合成在这一过程中不存在的观点。我们的看法是，植物生物聚合物确实能降解，但不完全降解，在这个过程中，小分子形成聚集体，可以进行反应或化学改性，我们称之为二次合成。他们还声称，进一步对不同粒级土壤的固态13C NMR研究表明，枯枝落叶层中的植物生物聚合物通过生物降解而均匀损失（Baldock 等，1992），因此在富含矿物质的组分中，唯一的残留物是微生物残体。

在本报告中，我们通过考查3种低矿质泥炭土，一种富含铁（Fe），另一种含有适量的铁，第三种不含铁，与传统的黄腐酸和腐植酸的碱提取物进行比较，提供的证据挑战了腐殖质是合成产物的解释，并表明这一观点存在显著缺陷。我们追踪了2 种泥炭中每个组分的产量，并通过固态13C NMR 定量技术对整个土壤和相关组分进行了分析。

Cao 和Schmitt Rohr（2018）通过使用类似的13C NMR 方法比较来自许多地方的腐植酸与植物生物聚合物，挑战了土壤中不存在腐殖化作用这个观点。在他们的论文中，他们质疑溶液NMR 的证据，认为它不能代表腐植酸，因为Kelleher 和Simpson（2006）使用的尖峰信号可能失真。基于我们在固体和溶液NMR 方面都有丰富的经验（Hatcher 等，1981；Simpson 等，2003），我们同意这一评论。腐植酸通常被认为是降解的植物生物聚合物通过氧化改性而形成，以至于它们具有相当大量的含氧官能团。与原有的生物聚合物相比，降解过程也降低了它们的分子大小。这些特性（功能和大小）决定了它们在稀碱中的溶解度，使得它们容易被多种过渡金属螯合，特别是铁，导致在溶液中形成聚集体。这两个过程的共同作用是显著改变它们的NMR 自旋晶格和自旋-自旋驰豫，以至于它们相对于源自没有这些特征的结构化植物生物聚合物的分子，在多维溶液NMR 中的可观察性差（Cao 和Schmidt Rohr，2018）。

在固态13C NMR波谱学中，聚集效应不是问题，但顺磁性金属的影响众所周知，特别是如果这些金属在有机碳中心的25-Å 半径之内。一些研究强调了在土壤或类土壤材料中的这种效应（Pfeffer 等，1984；Dai 和Johnson，1999；Smernik 和Oades，1999；Smernik 和Oades，2002；Schwertmann 等，2005），并试图从SOM 中去除铁，但效果一般。这个过程中可获得更高分辨率的NMR 波谱，但是，通过氢氟酸消解法去除铁被证明降低了碳回收率（Gonsalves，2003）。我们的策略是考查3 种铁含量不同的泥炭，并通过离子交换从腐植酸中去除铁，从而使NMR 波谱不受影响。

本报告的结果很简单。我们获得了以下3 种固态13C NMR 定量波谱（i）原始泥炭、（ii）腐植酸和（iii）通过标准方法提取和分离的腐黑物，即用离子交换树脂处理碱提取物以去除钠和其他金属。然后将提取物和不溶性腐殖质冻干，并按与原始土壤产量相同的比例加入，形成重组的泥炭SOM。我们的目标是挑战Lehmann 和Kleber（2015）提出的关于碱提取会产生人工制品的观点。如果腐殖质是人工制品，那么重组土壤的波谱就不会与原始的波谱相似。Cao 和Schmidt Rohr（2018）已经再次证实了众所周知的植物生物聚合物与腐殖质提取物不相似，这一点在之前的许多研究中得到了证实（Atalla 和Vanderhart，1984；Tegelaar 等，1989；Kögel-Knabner 等，1992；Preston，1996）。这些发现本身就表明，二次合成是真实发生的。如果腐殖质提取物与原始泥炭或腐黑物有显著差异，并且重组后的泥炭谱与原始泥炭谱完全吻合，那么这将表明碱性处理对SOM 没有实质性的改性，与Lehmann 和Kleber（2015）的说法相反，腐殖化过程在泥炭中着实存在。然而，如果腐植酸的波谱与原始土壤有很大的不同，并且重组产生的波谱与原始土壤有显著的不同，那么可能有几种解释：（i）腐殖质提取物是人造的前提假设有效，和（ii）腐植酸存在于整个土壤中的原始波谱受到顺磁性金属的影响，并不能定量代表被分析的有机质。

1 材料和方法

Okefenokee 沼泽（美国乔治亚州）的落羽松属泥炭及其相应的腐植酸组分和腐黑物组分来自之前的一项研究（Hartman 等，2015）。Indonesia（印度尼西亚）的泥炭样品之前也研究过（Orem 等，1996）。第3 个样品来自Everglades（美国大沼泽地国家公园第二保护区）的中心部分。样品通过改进的国际腐殖质学会（IHSS）方法进行制备。简单地说，泥炭样品在氮气（N2）保护下用0.1 M 氢氧化钠（NaOH）提取24 h，用离心法从可溶性腐植酸-黄腐酸组分中分离出腐黑物组分，再用超纯水洗涤腐黑物、再离心，直至呈中性，再进行冻干。将含有腐植酸和黄腐酸的氢氧化钠提取物用阳离子交换树脂（Dowex 50WX8）处理去除钠和其他金属，然后使用盐酸（HCl）酸化（pH=2），使深色的腐植酸沉淀，再采用离心法分离腐植酸和黄腐酸，之后冻干。最后的腐植酸残渣用稀盐酸冲洗几次，然后冻干。对于Indonesia 泥炭样品，在13C NMR 分析之前，将腐黑物、腐植酸和黄腐酸的冻干组分用研钵和研杵重新混匀。

在岛津TOC-VCPH（岛津科学仪器公司）上，通过高温燃烧（720 ℃）测量溶解有机碳和总溶解氮浓度。用邻苯二甲酸氢钾（KHP）和硝酸钾（KNO3）制作标准校准曲线，分别确定溶解有机碳和总溶解氮浓度。

采用含CHN 柱的元素分析仪（Flash 1112 系列）测定颗粒样品中的有机碳含量和氮含量。取约1.5 mg 样品放在3.3 mm×5 mm 锡杯中，在900 ℃下有氧燃烧，利用标准烟酰胺化合物提供校准曲线。

总铁浓度采用配有铁空心阴极灯的日立Z8100 偏振塞曼火焰原子吸收分光光度计测定。铁标准是用硫酸铁在稀硝酸（2% HNO3，痕量金属级）中作为参考标准溶液而得到。玻璃瓶酸洗后用于样品储存和处理。分析过程如下：约5 ～10 mg 样品在500 ℃炉中燃烧16 h 以上，然后，将得到的灰分用4 mL 浓酸混合物（1 ∶1 HNO3/HCl，V/V，痕量金属级酸）在85 ℃下消解并慢慢排气。待液体蒸发至初干后，再加入4 mL 浓酸混合物重复消解和蒸发过程。之后，将干燥后的残渣悬浮在4 mL 的8 M HNO3中，并在5000 转/分下离心15 min。此冲洗和离心过程重复一次，将上清液合并，在85 ℃下蒸发至初干。然后，在火焰原子吸收测量之前，将样品重新溶解在4 mL 2%HNO3之中。

所有NMR 实验均在配备有4-mm H-X 魔角旋转（MAS）探头的Bruker Advance II 波谱仪上进行，1H 共振频率为400 MHz，13C 共振频率为100 MHz。将13C 化学位移校准为甘氨酸外标（176.03 ppm）。使用复合脉冲多次交叉极化（multiCP）收集定量的13C NMR 波谱，与直接极化NMR 实验相比较，具有更大的信噪比（Johnson和Schmidt Rohr，2014）。将60 ～100 mg 的样品装入锆转子中，用Kel-F 盖子密封后进行分析。对每个样品的采集参数进行了优化，在14 千赫兹的旋转速率、0.4 秒的可变复极化周期（Tz）和1 秒的循环延迟进行5000 ～10000 次扫描。Cao 和Schmidt Rohr（2018）的研究表明，腐植酸和生物聚合物的多次交叉极化MAS（CPMAS）产生的波谱几乎等同于定量的直接极化MAS。

2 结果和讨论

3 种泥炭来源的冻干泥炭土的固态13C NMR 波谱如图1 所示。来自Indonesia 的样品被视为低铁泥炭（Wüst 等，2008 年），因为它采自于一个大的贫营养沼泽，那里的水和无机物主要来自于降雨。Okefenokee 样品也来自泥炭环境，但这片沼泽的面积更为有限，位于美国东海岸附近的一个近海盆地。第3 个样品来自佛罗里达州的Everglades 大沼泽。表1 中列出了总铁的测量结果，与Indonesia泥炭相比，Everglades 泥炭和Okefenokee 泥炭富含铁。3 个泥炭全土的波谱（图1）在存在的峰和相对丰度方面非常相似，主要变化是碳水化合物含量，即在65、72、84 和105 ppm 时的信号。代表脂肪族的主要峰在30 和33 ppm，具有典型的角质层特征，主要来自于叶凋落物。57、120、130 和150 ppm 的峰是木质素的特征。3 个样品在175 ppm处的峰，主要与羧基或酰胺官能团有关。最后，在175 和220 ppm 之间观察到醛/酮碳的信号。

从3 个泥炭样品中提取的腐植酸的固态13C NMR 波谱如图2 所示。最引人注目的观察结果是腐植酸谱图的相似性，以及芳香碳的强度明显高于各自全样，特别是130 ppm 处的大峰。同样明显的是，脂肪族碳的强度较低（0 ～50 ppm），特别是在Everglades 腐植酸中（图2）。33 ppm 处的尖峰属于在叶角质层中发现的有序聚亚甲基结构，是腐植酸波谱的一个次要成分。在57、120、130和150 ppm 的腐植酸波谱中，木质素的主峰也清晰可见。由175 ppm 处峰表示的羧基/酰胺官能团的增加强度与芳族碳成比例，这可能是他们被NaOH溶解的原因。归一化为芳香碳后，腐植酸中羧基/酰胺峰的相对强度与所在全样的相对强度相似，表明腐殖质和泥炭全样之间存在类似的芳香结构单元。当腐植酸的波谱与各自的全土进行比较时，主要差异在于脂肪族结构和碳水化合物显著减少，导致芳香族和羧基/酰胺官能团选择性富集。这些观察结果与以下观点一致，即选择性溶解是腐殖质和SOM 之间主要波谱差异的原因，而不是一些无法解释的化学变化，即与NaOH 反应产生人工制品。

图1 3 个泥炭样品的固态13C 核磁共振（NMR）波谱Fig.1 Solid-state 13C nuclear magnetic resonance (NMR)spectra of the three peat samples.

图2 3 个泥炭腐植酸样品的固态13C 核磁共振（NMR）波谱Fig.2 Solid-state 13C nuclear magnetic resonance (NMR)spectra of the three peat humic acid samples

为了在不受Fe 影响的样品上检验这一假设，我们基于传统的碱提取法将Indonesia 泥炭样品分离为几个组分。如上所述处理泥炭全样，以分离腐植酸、腐黑物（不溶于碱）和黄腐酸（碱和酸溶组分）。表2 显示了每个组分的百分含量。用0.1 M NaOH 进行碱提取，从这个低灰分（0.75%）和低Fe 含量的泥炭样品（表1）中去除了约一半的有机质。提取物主要是腐植酸，占样品的42.2%，而黄腐酸则占9.8%。腐黑物的固态13C NMR 波谱见图3。在黄腐酸组分中回收的材料不足以获得NMR波谱。腐黑物的波谱表明存在显著的碳水化合物衍生信号（65、72、84 和105 ppm），这证实了泥炭的这些成分没有在碱液中溶解、而是作为碱提取的不溶性残渣（腐黑物）中的主要成分。由于碳水化合物信号相当尖锐，并且在84 ppm 时存在明确的信号，因此该碳水化合物很可能是不溶于碱的结晶纤维素（Atalla 和Vanderhart，1984）。由0 ～50 ppm 范围内的脂肪族尖锐信号表示的脂肪族、叶角质层衍生的物质在腐黑物中也比在腐植酸中更突出，线宽更窄，这表明它们也是原始植物残渣，在碱中的溶解度有限。最能说明问题的是，指示木质素的峰（57、120、130 和150 ppm）显示了一个更典型的未改变或最小改变的木质素分布模式，在57 ppm 和150 ppm 分别为甲氧基和氧取代芳基的强峰，正如所观察到的那样，是从新鲜木材或仅部分改变的木材中分离木质素最强峰（Hatcher，1987；Holtman 等，2007；Mastrolonardo 等，2015；Cao 和Schmidt Rohr，2018）。腐植酸中木质素峰（图2）在57、120、130 和150 ppm 处显示不同的相对强度分布，表明腐植酸中木质素衍生成分已从其在新鲜植物材料中的原始状态改性，例如，甲氧基在57 ppm 处峰不像在分离木质素中那样突出，在150 ppm 处的峰不如在130 ppm 处的峰。或者，木质素的峰可能保留了它们的相对强度，但是在样品中已经进化的新材料在130 ppm 产生大信号，该信号与木质素在该区域的信号重叠。

Lehmann 和Kleber（2015）认为这证明NaOH改性了泥炭样品。与之形成鲜明对比，我们认为腐植酸代表被腐殖化的原始植物材料，这些植物材料经历了二次转化，以至于它们比未改变的植物生物聚合物更溶于稀碱，并且其波谱与腐黑物中改变最小的植物衍生聚合物不同。仅凭波谱无法确定上述哪种解释更有效。

表2 冻干泥炭样品中腐植酸、黄腐酸和腐黑物的重量百分比Tab.2 Weight percentage of humic acids, fulvic acids,and humin in the freeze-dried peat samples %

图3 泥炭样品中腐黑物的固态13C 核磁共振（NMR）波谱Fig.3 Solid-state 13C nuclear magnetic resonance (NMR)spectra of humin from peat samples

NaOH 人工制造腐植酸的的情况，一个实验是将每个碱分离的干燥提取物（腐黑物、腐植酸和黄腐酸），按照在泥炭中相同的比例将它们重组，然后将重组的波谱与原始泥炭的波谱进行比较。图4 显示了Indonesia 和Everglades 泥炭的比较。原始泥炭波谱本质上与重组组分相同，仅在100 ～160 ppm 的共振区域（芳族区域）存在微小差异。这种重建原始样品波谱的能力强烈表明碱提取不会产生人工制品，并且，腐植酸是泥炭中的真实成分，特别是考虑到腐殖质提取物占Indonesia 泥炭样品很大的质量比（表2）。

100 ～160 ppm 区域共振强度的微小差异可能与通过离子交换树脂处理去除腐植酸和黄腐酸组分中的某些有机物有关。或者，这可能是由于腐植酸通过离子交换去除了一些铁。我们正在仔细研究这种可能的影响，并将在适当时候报告这一点。

图4 Indonesia 和Everglades 泥炭全土和重建泥炭土的叠加固态13C 核磁共振（NMR）波谱Fig.4 Superimposed solid-state 13C nuclear magnetic resonance (NMR) spectra of whole soil and the reconstituted Indonesia and Everglades peat soil

我们应用Baldock 等（2004）的生物聚合物混合模型到Indonesia 和Everglades 泥炭的全土、腐黑物、腐植酸以及重组样品的波谱上（图5）。混合模型假设SOM 由生物聚合物（碳水化合物、木质素、脂质、蛋白质、炭和不属于任何生物聚合物类别的额外羧基官能团）的混合物组成，其NMR波谱信号预期是由每个单独的生物聚合物构成，因为单个生物聚合物的存在形式不变。

数据表明，如上所述，模型中单个生物聚合物的相对贡献对于2 种泥炭的全样和重组组分是相似的。腐植酸和腐黑物组分在2 种泥炭样品中的相对生物聚合物贡献明显不同。最大的区别与标记为炭的成分有关，而燃烧来源的生物炭是该成分的主要来源。通过波谱分析，发现2 种泥炭腐植酸分别含有约21%和31%的这种炭，而腐黑物下降严重，仅含8.3%和12.3%。此外，碳水化合物含量也差异显著，其中，腐黑物分别富含26.2%和14.6%、而腐植酸分别仅含有5.2%和3.6%碳水化合物。可见，碳水化合物富含于腐黑物之中，因为它们在稀碱中的溶解度有限，在提取腐植酸过程中始终是不溶物。

图5 Indonesia 和Everglades 泥炭腐植酸(HA)、全土、腐黑物和重组或混合样品的固态13C 核磁共振(NMR)波谱的各种生物聚合物成分的相对含量Fig.5 Relative amounts of various biopolymer constituents from solid-state 13C nuclear magnetic resonance (NMR) spectra of humic acids (HA), whole soil, humin, and the recombined or mixed Indonesia and Everglades soil

最有趣的是，对于Indonesia 和Everglades 2 种泥炭样品，炭在腐植酸中的浓度比在腐黑物中的高。通常生物炭非常不溶于水性溶剂（Bostick 等，2018），并被认为保留在腐黑物组分中，与此处观察到的相反。

本研究中炭在用稀碱处理后变得可溶，并成为腐植酸组分，这一事实表明，该炭是从二次合成转变而来。Chen 等（2014）表明，当溶解的有机质在模拟太阳光下降解时，会形成黑色沉淀，并且该物质可溶于稀碱。在该研究中，当pH=3.5 时观察到沉淀，并且黑色沉淀物显示为高度芳香性，由缩合的芳族碳组成，就像在烧焦的材料中通常观察到的那样。Chen 等（2014）提出，这种物质代表黑碳样有机质，通过光化学产生的羟基自由基对溶解的有机质进行非燃烧氧化而形成。之后，DiDonato等（2016）、DiDonato 和Hatcher（2017）提出，这种存在于土壤腐植酸中的物质，在氧化过程中形成，产生了羟基自由基。Trusiak 等（2018）指出，羟基自由基容易在富铁土壤中形成，这类土壤接收降雨带进来的溶解氧。他们认为，随后的有机质氧化会从土壤中释放出二氧化碳。尽管Fenton化学是作用于SOM 的非生物过程，但文献中有充分的证据表明土壤中的微生物（例如细菌和真菌）具有产生酶的能力，从而导致羟基自由基和其他的活性氧种类的产生（Crawford，1981；Higuchi，1990）。这些种类活性氧可以与土壤中许多SOM生物聚合物，例如木质素（Higuchi，1993）、多糖（Morelli 等，2003）和蛋白质发生反应（Sun 等，2017）。

在这样的条件下，很可能发生Fenton 型反应将SOM 转化为氧化产物，这些产物成为可提取的腐殖质，构成土壤的一部分，并且持续的Fenton氧化最终会在很长一段时间内导致矿化。因此，现代土壤中的腐殖质可以看作是SOM 矿化过程的中间产物。

我们的混合实验表明，碱性提取物（例如腐植酸和黄腐酸）是现代SOM 的组成部分。

致谢和参考文献（略）

译自：Journal of Environmental Quality，2019，48：1571 ～1577。