肠道菌群和代谢相关脂肪性肝病的因果关联：一项双样本孟德尔随机化研究

孟勇，蒋维荣，李瑞，徐镇，陈文浩，李志文

（1. 西北大学附属医院西安市第三医院普外四科，陕西 西安 710018；2. 西北大学医学院，陕西 西安 710069）

代谢相关脂肪性肝病（metabolic associated fatty liver disease，MAFLD）是一种非明确损肝因素所致的，以肝细胞脂肪变性和脂肪过度沉积为病理学特征的临床综合征，其与2型糖尿病和动脉粥样硬化等代谢性、心血管疾病显著相关，可直接导致肝硬化和肝癌［1-3］。近年来，MAFLD的发病率逐年上升，全球患病率已高达25.24%，是世界范围内最常见的肝病类型，严重威胁着人类的健康，被公认为21世纪主要的健康负担之一［4］。

MAFLD是一组高度异质性疾病，其发生发展的影响因素众多，发病机制尚不完全清楚。随着肠-肝轴概念的提出，多项研究［5-7］显示，肠道菌群紊乱与MAFLD的发生显著相关。但因肠道菌群与MAFLD的关联受到多种混杂因素和反向因果关联的影响，使其在传统的流行病学研究中的因果推断受到限制［8］。肠道菌群与MAFLD之间是否存在因果关系尚不清楚。孟德尔随机化研究方法可以有效地避免观察性研究中的混杂因素、反向因果关系，以及RCT研究中的代表性、可行性等问题［9］。然而，目前尚未见通过孟德尔随机化方法来评估MAFLD与肠道菌群之间因果关系的研究报道。因此，本研究采用孟德尔随机化的方法，利用单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphisms，SNP）作为工具变量（instrumental variables， IV），探索肠道菌群与MAFLD之间的因果关系，以期为MAFLD的预防和治疗提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 数据来源

获取GWAS的汇总数据，采用双样本孟德尔随机化分析肠道菌群和MAFLD的因果关系。肠道菌群的IV来自MiBioGen联盟中Kurilshikov等［10］的研究，数据包括美国、英国、韩国等12个国家的18 473个人16S rRNA基因测序图谱和全基因组基因分型数据，在门、界、目、科、属5个水平共获取122 110变异位点。

MAFLD的GWAS数据来自Ghodsian等［11］的GWAS荟萃分析研究，该研究汇总分析了eMERGE、FinnGen、Estonian Biobank和FinnGen队列的GWAS数据，纳入MAFLD 8 434例，正常人群770 180例。

1.2 IV的选择

为了确保肠道微生态与MAFLD间因果关系结论的真实性和准确性，研究采用如下的筛选条件选择最佳的IV，① 为获得更加全面的数据，从肠道菌群的GWAS数据中选择与肠道菌群最具相关性的SNP，选取P<5×10-5的SNP；② 基于MR的独立性假设，各个SNP需相互独立，为确保各IV间不存在连锁不平衡（linkage disequilibrium，LD），设定LD系数R2为0.001，域宽度为10 000 kb；③ 为确保同一SNP在肠道菌群组和MAFLD组具有相同的等位基因，去除了回文SNP；④ 当MAFLD的GWAS数据中不存在与肠道菌群相关的SNP时，为确保结果的真实性和准确性，删除无替代位点的IV。流程如图1示。

图1 流程图

1.3 孟德尔随机化（mendelian randomization MR）假设

根据孟德尔随机化分析要求，遗传变异作为IV需满足以下三个核心假设：① 独立性假设：所选IV独立于影响肠道菌群和MAFLD的混杂因素；② 关联性假设：IV与肠道菌群必须有很强的相关性。通过计算F统计量用以评估工具变量与暴露因素之间的相关性强度，F>10认为满足关联性假设；③ 排他性假设：IV只能通过肠道菌群影响MAFLD，而不能通过其他途径，即IV与MAFLD之间不应存在水平多效性（图2）。

图2 核心假设

1.4 统计学方法

采用R 4.3.0中TwoSample MR 和MR-PRESSO等R包进行MR分析和敏感性分析。

1.4.1 MR分析 本研究采用反向方差加权，MR-Egger回归和加权中位数3种方式进行MR分析，推断肠道菌群和MAFLD是否存在因果关系。当不存在水平多效性时，以IVW分析结果为主，其特点是回归分析时不考虑截距项并且用结局方差的倒数作为权重来进行拟合。根据是否存在异质性，在IVW检验选择固定或随机效应模型。MR-Egger回归即使在所有的IV都具有基因多效性的情况下也可以得到一致性的估计，加权中位数法的优势主要是：即使有超过 50% 的无效工具变量，仍可以一致性地估计因果关系。因此，研究将MR-Egger回归和加权中位数则作为补充的方法。P<0.05为差异具有统计学意义。

1.4.2 敏感性分析 通过Cochran′s Q统计量来检验异质性。采用MR-PRESSO方法对离群值进行检测，若存在离群值，则将其剔除，并重新进行分析。通过MR-Egger进行水平多效性检验，若MR-Egger分析中的截距项差异具有统计学上的显著性意义，则表明该研究具有明显的水平多效性。通过“留一法”评估MR结果的稳定性。P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 工具变量选择结果

通过对肠道菌群GWAS数据的筛选，共选择14 551个SNP作为IV，来代替211种肠道菌群，包括五个生物学分类，其中9个门、16个纲、20个目、35个科和131个属，每个工具变量均满足F>10。

2.2 MR分析

IVW结果显示：乳酸杆菌科（OR=0.830，95%CI0.708~0.973，P<0.05），克里斯滕森菌属R7群（OR=0.737，95%CI0.589~0.920，P<0.01），罗氏菌属（OR=0.501，95%CI0.732~0.989，P<0.05）可能是MAFLD发生的保护因素，而放线菌科（OR=1.250，95%CI1.020~1.532，P<0.05），草酸杆菌科（OR=1.101，95%CI1.007~1.205，P<0.05），放线菌目（OR=1.250，95%CI1.020~1.533，P<0.05），NB1n目（OR=1.110，95%CI1.006~1.226，P<0.05），瘤胃球菌科UCG-005群（OR=1.181，95%CI1.013~1.377，P<0.05）可能是MAFLD发生的危险因素。同时放线菌科，放线菌目，克里斯滕森氏菌属R-7群和MAFLD的关系还得到了Weighted median的结果支持。此外，Weighted median结果提示副萨特氏菌属可能也MAFLD发生的危险因素，但在IVW和MR Egger中未得到显著性结果（表1）。

表1 MR分析结果

2.3 敏感性分析

通过Cochran′s Q统计量进行异质性检验提示P<0.05，各合并的工具变量间无显著异质性，IVW均采用固定效应模型。通过MR-PRESSO方法对离群值进行检测，结果显示P>0.05，未检测到离群值。通过MR-Egger进行水平多效性检验，结果未显示出现水平多效性，P>0.05（表2），并且通过留一法评估MR结果的稳定性，结果显示不存在单个SNP对研究结果的稳定性产生较大影响效应，因此认为肠道菌群和MAFLD的MR分析结果具有稳定性。

表2 MR敏感性分析

3 讨论

20世纪80年代，Drenick教授在接受肠旁路手术的患者中观察到肝脂肪变性与肠道菌群的异常显著相关，这意味着肠道菌群的改变可能影响MAFLD的发生和发展［12］。近年来，有学者提出肠-肝轴学说以解释这种关联，肠-肝轴是肠道生态通过门静脉血流和肝脏形成联系、相互影响的学说，肠道菌群可以通过多种机制影响MAFLD的发生和发展，如改变肠道的通透性、改变能量的摄取、调节胆碱代谢和胆汁酸的生成。此外，部分肠道菌群可以发酵碳水化合物形成内源性乙醇，刺激炎症信号加重肝脏损伤，加速MAFLD的发展［6，13-14］。

随着肠-肝轴学说的不断发展，越来越多的证据表明肠道菌群在MAFLD的发生过程中扮演着重要角色［15］，但是MAFLD的发生与肥胖、糖尿病、高脂血症、胰岛素抵抗及遗传易感等诸多因素相关。目前的多数肠道菌群和MAFLD相关性的研究不仅受到上述混杂因素的影响，而且多为病例对照研究［16-18］，并不能有效阐明两者的因果关系。因此，采用双样本MR方法，从门、纲、目、科、属全5个生物学层面评估肠道菌群与代谢性脂肪肝的因果关系。结果显示乳酸杆菌科、克里斯滕森菌属R7群、罗氏菌属可能是MAFLD发生的保护因素，而放线菌科、草酸杆菌科、放线菌目、NB1n目、瘤胃球菌科UCG-005群可能MAFLD发生的危险因素，这与Yang等［19］的研究结果一致。

不同的肠道菌群可能通过不同的通路和机制影响MAFLD。乳酸杆菌科主要依赖于Toll样受体2和蛋白激酶C，对肠上皮屏障功能具有保护作用，改变肠道的通透性减少来自肠道的有害物质对肝脏的影响。此外，乳酸杆菌可以抑制HMG-CoA还原酶，减少肠道对胆固醇的吸收，降低血清胆固醇和三酰甘油［20］，从而降低MAFLD的发生率。克里斯滕森菌属于厚壁菌门，2012年首次被发现并命名，其作用机制尚不清楚［21］，但多项研究［22-24］显示，克里斯滕森菌与体内三酰甘油水平降低及高密度脂蛋白水平升高呈显著正相关，而与总胆固醇、低密度脂蛋白和载脂蛋白B升高呈负相关。因此，克里斯滕森菌被认为是新一代的益生菌。目前，针对单一菌群和MAFLD相关性的研究较少，暂未见NB1n目、克里斯滕森氏菌属R-7群、副萨特氏菌属和瘤胃球菌科UCG-005群与MAFLD的研究报道，其影响机制尚不完全清楚，值得进行研究。

本研究分析了来自大样本量的GWAS汇总数据，MR具有较强遗传因果推理能力，因此本研究结果应该是可靠的，但仍具有一定的局限性。第一，本研究中的GWAS汇总数据多来自欧洲，其结论推广到其他种族和地区的个体时，应谨慎。第二，由于数据来自不同人群，结果可能会受到一些混杂因素的影响，未来可能需要对同一人群的数据进一步研究。第三，由于缺少符合MR研究假设的肠道菌群相关的数据，因此未进行反向MR分析。

综上所述，本研究揭示了肠道菌群与MAFLD的因果关系，筛选出与MAFLD相关的肠道菌群，这些菌群可能成为新的生物标志物，为MAFLD的预防和治疗提供新的思路，并且有助于加深对肠-肝轴的认识和理解。