菊苣种子中五种生物活性成分检测分析

阿丽米热·买买提，吾买尔江·牙合甫，陈李鑫，阿里米热·阿不来提，王晓杰，2，阿卜杜萨塔尔·斯马依

（1.新疆农业大学动物医学学院/新疆草食动物新药研究与创制重点实验室，乌鲁木齐 830052；2.郑州赛科药业科技有限公司，郑州 450000；3.哈密阿沙尔诊所，新疆哈密 839000）

菊苣（Cichorium intybusL.）为菊科（Asteraceae）菊苣属多年生温带药用植物，在新疆阿勒泰、乌鲁木齐、塔城、哈巴河、福海、伊宁、哈密等地区分布较广［1］。菊苣全草（根、茎、叶、种子）入药，其活性成分具有调节血脂、保肝、治疗黄疸等功效，可明显改善高嘌呤饮食引起的肥胖、高尿酸血症疾病［2，3］。此外茎、叶是可食用的药食两用资源。在日常生活中，菊苣根、叶、子常用来泡水服用，市场有较多的菊苣茶相关产品。

菊苣全草植物含有酚酸类、萜类、糖类、黄酮类、苯丙素类、氨基酸、微量元素等多种化合物，已被广泛研究、开发利用，具有较高的研究价值［4］。由于植物所生长的地理位置、环境、品种、种植方式等不同，植物所含的药物活性成分、含量存在一定的差异。因此，本研究分析采自新疆哈密市菊苣种子中总多糖、总黄酮、总多酚、总皂苷、总生物碱的含量，为该地区菊苣种子生物活性物质提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

菊苣种子由新疆哈密阿萨尔生物科技有限公司提供，经哈密市伊州区花园乡卫生院卡哈尔·司马义鉴定为菊苣种子。

1.2 试剂与仪器

1.2.1 试剂 齐墩果酸标准品、芦丁、没食子酸、骆驼蓬碱、香草醛、硝酸铝购自北京索莱宝科技有限公司；福林试剂购自北京酷来博科技有限公司；葡萄糖标准品、苯酚、硫酸购自天津市科密欧化学试剂有限公司；溴化钾购自国药集团化学试剂有限公司。盐酸、碳酸氢钠、高氯酸、冰醋酸、甲醇、亚硝酸钠、氢氧化钠、氢氧化钙购自阿拉丁生物试剂有限公司。

1.2.2 仪器 UV-5500 型紫外可见分光光度计，上海元析仪器有限公司；RE-52A 型旋转蒸发仪，南通经典玻璃仪器有限公司；恒温水浴锅，金坛市医疗仪器厂；WD-9415E 型超声波清洗器，北京六一生物科技有限公司；其他相关仪器、耗材由新疆草食动物新药研究与创制重点实验室提供。

1.3 方法

1.3.1 菊苣种子水提物的处理 菊苣种子清洗后阴凉24 h，烘干粉碎，30 目筛网过滤，精准称取菊苣种子粉末100 g，按照菊苣种子∶灭菌蒸馏水1∶15 的比例加入蒸馏水，70 ℃冷凝回流2 h，经真空抽滤，液体备用（冷藏），残渣以1∶10 料液比70 ℃冷凝回流1.5 h，真空抽滤，合并上述滤液，浓缩，取浓缩液置烘干箱（45 ℃）烘干，即可获得菊苣种子粗提物，置于-20 ℃冰箱备用。

1.3.2 菊苣种子水提物的成分测定

1）总多糖的测定。采用苯酚-硫酸显色法测定，精确称取葡萄糖、菊苣标准品各25 mg，蒸馏水定容，最终获得浓度为0.1 mg/mL 的标准液、测试液。依次吸取0.1 mg/mL 的标准液、测试液0（蒸馏水代替）、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL 定容至2.0 mL，取5%苯酚、5 mL 浓硫酸依次加入定容瓶，混匀、冷却，30 ℃水浴20 min。用紫外可见分光光度计于波长490 nm处测定吸光度，绘制标准曲线，计算总多糖含量［5］。

2）总生物碱的测定。采用盐酸法测定，精确称取骆驼蓬碱标准品10 mg 用蒸馏水定容，获得浓度为0.1 mg/mL 的标准液；取10 mL 标准液用0.1 mol/L的HCl定容，获得0.02 mg/mL 溶液；依次吸取1、2、3、4、5、6 mL 溶液至玻璃试管中，添加0.1 mol/L HCl 至试管中溶液总量为10 mL，振荡混匀，分光光度计345 nm 处测定吸光度，根据标准溶液OD值绘制标准曲线。精确称取菊苣种子粗提物5 mg 用蒸馏水定容，同步以上方法测定总生物碱含量。

3）总 黄 酮 的 测 定。采 用NaNO2-Al（NO3）3-NaOH 显色法测定，精确称取芦丁10 mg，用80%乙醇定容，获得浓度为0.4 mg/mL 的标准液；依次吸取0（蒸馏水代替）、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL 标准液至试管中，分别加入5%NaNO2溶液0.3 mL 混匀后静置6 min；加入10% Al（NO3）3溶液0.3 mL，混匀后静置6 min；各管加入4% NaOH 溶液4 mL，蒸馏水定容至10 mL，静置10 min；分光光度计510 nm 处测定吸光度，根据测得的OD值绘制标准曲线。精确称取菊苣种子粗提物10 mg，同步以上方法测定总黄酮含量。

4）总皂苷的测定。使用香草醛-高氯酸显色法测定，精确称取齐墩果酸标准品20 mg，用甲醇定容，获得浓度为0.8 mg/mL 的标准品溶液；依次吸取0（蒸馏水代替）、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.12 mL标准品溶液至试管中，加入5%香草醛-冰乙酸0.2 mL，振荡混匀后加入高氯酸0.6 mL，试管封口并置于65 ℃恒温水浴锅20 min；冷却后吸入冰乙酸5 mL，振荡摇匀，用蒸馏水定容至10 mL，摇匀。分光光度计550 nm 处测定吸光度，根据OD值绘制标准曲线。精确称取菊苣种子水提物20 mg，同步以上方法测定总皂苷含量。

5）总多酚的测定。使用Folin 显色法测定，精确称取没食子酸标准品10 mg 置于100 mL 容量瓶，蒸馏水定容；依次吸取0.25、0.50、0.75、1.00、1.25、1.50 mL 溶液置于10 mL 容量瓶，缓慢吸入Folin 试剂1 mL，混匀；吸入12% NaHCO3溶液2 mL 溶液，蒸馏水定容，振荡混匀，锡箔纸避光放置1 h，分光光度计765 nm 处测定吸光度，绘制标准曲线。精确称取菊苣种子水提物25 mg，置于容量瓶，同步以上方法测定总多酚含量。

1.3.3 可信度检测 为保证结果的可信度，分别进行精密度、稳定性、重复性和加标回收率检测试验。

1）精密度检测。分别配制标准液葡萄糖、骆驼蓬碱、芦丁、齐墩果酸、没食子酸1.25、1.00、1.00、1.20、1.50 mL，按照相对应的显色方法显色，分别于490、345、510、550、765 nm 测定吸光度，每种标准液均测定6 次，计算标准偏差（RSD）。

2）稳定性检测。测得显色后的5 种标准液和样品的最大吸光度，在最大波长处，每隔0.5 h 测定其吸光度，测定6 次，并计算RSD。

3）重复性检测。取同一批菊苣种子粉碎后，过20 目筛，按照5 种样品液制备方法，分别配制5 组样品液，每组6 份，于相应波长处测定吸光度，计算RSD。

4）加标回收率。使用重复性试验中剩余的样品液，按照标准曲线中的浓度梯度随机抽取3 个浓度，每组按相同体积显色，在每种成分的最大波长处测定其OD值，计算回收率、平均回收率及RSD。

2 结果与分析

2.1 可信度检测

如表1 所示，标准液总多糖、总生物碱、总黄酮、总皂苷、总多酚精密度检测RSD分别为1.74%、1.83%、1.73%、0.64%、1.71%，符合检测要求，精密度良好；稳定性检测中3 h 内5 种标准品、样品成分均具有较强的稳定性；重复性检测RSD分别为0.79%、2.35%、2.03%、2.10%、1.79%，符合检测要求，测定方法重复性良好，表明该检测方法可靠，具有参考应用价值。

表1 加标回收率试验结果 （单位：%）

2.2 菊苣种子5 种活性成分含量测定

如表2 所示，菊苣种子5 种活性成分测定中，活性成分含量大小依次为总多糖（29%）＞总黄酮（19%）＞总多酚（11%）＞总皂苷（8%）＞总生物碱（2%）。由此可见，菊苣种子中总多糖、总黄酮含量较高，合理利用具有很大的经济价值。

表2 菊苣种子5 种活性成分含量回归方程

3 讨论

菊苣所含生物活性物质具有降血糖、抗氧化、增强免疫、降血脂等多种功效，被40 多个国家认可、允许作为食品的营养增补剂。菊苣种植范围广、药材廉价、安全性高，菊苣露、护肝布祖热颗粒（种子∶根为2∶1）［6］、炎消迪娜儿糖（种子∶根为1∶2）［7］、复方木尼孜其颗粒（种子∶根为1∶1）［8］等产品已广泛应用于脂肪肝、肝炎、调节体液等疾病。臧薇等［9］报道毛菊苣粗提物（种子∶根为1∶2 和2∶1）对HepG2 细胞产生的抑制率、凋亡率高于单个给药剂量，显著增加S期细胞占比和降低G2 期细胞占比。

通过已报道菊苣相关文献分析，菊苣中多糖类、黄酮类、多酚类、皂苷类、生物碱类生物活性物质含量均有一定的差异，一方面与菊苣所生长的地理环境、种植年限、密度、野生、栽培、品种因素有关。卓玛草等［10］选取菊苣Puna Ⅱ和Choice 2 个品种，研究黄土高原产草量及营养品质，结果表明品种Puna Ⅱ的营养价值高于Choice。王贵等［11］选取菊苣TOPSCORE 品种分析不同种植密度对根用菊苣表型性状及营养品质的影响，结果显示种植密度为1.33×105株/hm2的菊苣营养品质指标含量较高。另一方面与现代提取工艺、溶剂、仪器等因素有关。本研究区域菊苣种子中总多糖（29%）含量最高，其次为总黄酮（19%）。吴雨龙［12］报道菊苣多糖分离率为46.75%，由果糖、葡萄糖、山梨醇等成分组成。薛顺［13］采用水提法测得菊苣粗多糖分离率为18.93%。研究表明，菊苣多糖能够促进胰岛素分泌，影响糖代谢酶的活性，抑制糖异生，改善肾脏过氧化状态，起到保护肾脏的作用［14，15］。庄红艳等［16］报道菊苣中多糖含量为53.82%，不同产地、不同批次菊苣总多糖含量存在差异。许芳等［17］报道优化超声波协同酶法提取菊苣根多糖获得率为46.75%。

黄酮类化合物是药用植物产生的一类次级代谢产物，具有抗氧化、抗炎、改善心血管等多种作用。菊苣检测出黄酮类成分40 余种，其中以黄酮醇、黄酮、花色素和苷类为主［13］。赵月等［18］通过响应面法确定超声-微波协同萃取栽培菊苣种子总黄酮，结果表明总黄酮提取得率为93.23 mg/g，栽培菊苣种子中的主要黄酮成分是绿原酸和洋蓟素，洋蓟素对DPPH 自由基的清除作用较大。刘馨瑶等［19］采用加热回流法提取结球菊苣中总黄酮取率为4.11%；陈永平［20］报道菊苣根采取超声波、复合酶解提取方法测得总黄酮得率为（5.43±0.12）mg/g。翁馨等［21］对毛菊苣地上部分的化学成分进行研究，分离出新的黄酮苷化合物槲皮素-3-O-［6"-O-（3-乙氧基-1，3-二氧代丙基）］-β-D-吡喃葡糖苷（1）。

多酚类化合物有良好的清除体内自由基、抑制脂质过氧化等作用［22］。菊苣含有菊苣酸、绿原酸等多酚类物质，其中绿原酸具有抗氧化作用，菊苣酸具有增强免疫功能、抗炎作用。尚红梅等［23］报道菊苣种子总酚含量为10.17 mg/g，菊苣酚类化合物与菊苣根的抗氧化活性具有较大的关系。菊苣中含有咖啡因等生物碱，略带苦味，能增加浸煮液色泽，提高咖啡的溶解质量，纪可［24］报道菊苣根咖啡因提取率为2.14 mg/g。因此，常用作咖啡的添加物或代用品。

菊苣还有秦皮甲素、秦皮乙素、山莴苣素和山莴苣苦素等具有特殊生物活性的物质，也是菊苣保健功能的重要指标［25］。叶银松等［26］报道菊苣成分山莴苣素、山莴苣苦素具有较强的抑制肿瘤细胞增殖的作用，尤其对乳腺癌和结肠癌细胞的抑制作用较强。杨建等［27，28］报道毛菊苣种子中山莴苣素、山莴苣苦素、单咖啡酰酒石酸、绿原酸、菊苣酸含量分别为0.381 5、0.331 8、0.197 0、1.714 0、1.247 0 mg/g。布威海丽且姆·阿巴拜科日等［29］认为毛菊苣茎、根、叶秦皮乙素含量随着生长发育进程而发生变化，6—7 月枝叶茂盛时秦皮乙酸含量最高。努力比亚·阿不都克尤木等［30］报道毛菊苣中分离得到的母菊素可阻断大鼠肝星状细胞HSC-T6 的TGF-β/Smad 信号转导通路，抑制HSC-T6 激活，防止大鼠肝纤维化现象。