2021 年南通市某养老机构胃肠炎暴发疫情中诺如病毒分子分型分析*

陈 璐，季霄雷，虞 莹

(江苏省南通市疾病预防控制中心微生物检验科，南通 226007)

诺如病毒属于杯状病毒科诺如病毒属，是一种无包膜单股正链RNA 病毒，可以通过污染的水或食物传播，极微量的病毒颗粒(约100 个)即可发生感染[1]，是引起人类急性非细菌性胃肠炎的主要病原体，约50%的急性胃肠炎由该病毒引起[2]。其基因组全长7 000～7 700 bp，包括3 个开放阅读框(open reading frames,ORFs)：ORF1 编码包括依赖RNA 的RNA 聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase,RdRp)在内的非结构蛋白；ORF2 编码主要衣壳蛋白VP1；ORF3编码次要衣壳蛋白VP2[3]。根据VP1 区全基因组核苷酸序列的不同，可将其分为5 个基因组，其中GⅠ、GⅡ和GⅣ可感染人类，GⅡ感染最常见，而GⅡ.4一直是病毒性胃肠炎的主要基因型[4]。

2021 年2 月，南通市某养老机构发生一起急性胃肠炎暴发疫情，多名患者及工作人员出现恶心、呕吐、腹泻、腹痛等胃肠道症状，通过现场流行病学调查，结合实验室检测结果，证实是由诺如病毒重组株感染引起的。本研究通过核酸检测，核酸扩增，测序和进化分析，了解南通地区诺如病毒流行的分子分型，为今后的疫情防控提供资料。

1 对象与方法

1.1 标本来源 使用含无菌保存液的病毒采样管，采集发病患者肛拭子20 份，为查找传染源，同时采集无症状工作人员肛拭子10 份。无菌采样后均置于病毒保存管内冷链条件下4 h 送检南通市疾病预防控制中心实验室。

1.2 标本处理和核酸提取 送到即检，将标本充分涡旋振荡后离心，取上清液300 μL，使用上海之江全自动核酸提取仪(型号：EX 3600)和上海之江核酸提取试剂(批号：P20210106)提取核酸RNA，洗脱液为60 μL，-20 ℃保存备用。

1.3 实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR,RT-qPCR) 检测 使用中山达安诺如病毒核酸测定试剂盒(批号：20201202)，按照试剂盒说明书配置反应体系(25 μL)，检测仪器是ABI 7500 PCR 仪，反应条件为：50 ℃，15 min；95 ℃，15 min；94 ℃，15 s，55 ℃，45 s，40 个循环。循环数≤38，曲线呈S 型且有明显指数增长的判读为阳性。

1.4 目的基因扩增与测序 采用可同时扩增RdRp区和VP1 区的正向引物Mon431：5'-TGGACIAGRGGICCYAAYCA-3'，反向引物G2-SKR：5'-CCRCCNGCATRHCCRTTRTACAT-3'。逆转录PCR 使用上海生工Takara One-step RT-PCR 试剂盒(型号：RR055)一步法扩增诺如特征基因RdRp/VP1 区基因片段，目的片段长度为557 bp，扩增反应条件为：50 ℃30 min；94 ℃2 min；94 ℃30 min，65 ℃30 min，72 ℃1 min，35 个循环。扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定，将有阳性条带的产物送上海生工生物科技有限公司测序。

1.5 序列分析 将所测序列提交诺如病毒基因分型网站，获得其基因型别。再与GenBank 中的诺如病毒参考序列进行比对，Blast 寻找相似度最高的序列，使用MEGA 7.0 软件中的neighor-joining(NJ)-P距离法构建系统发育树，分析采用1 000 个序列组。

2 结果

2.1 疫情概况 本起暴发疫情发生地为南通市某养老机构，人员相对密集，暴发时间为2021 年2 月。首发病例为调查前1 d(2021 年2 月2 日)14:00 左右，其余病例的发病时间集中在17:00～20:00 时，年龄跨度比较大，59～104 岁，平均(80±20)岁，均为中老年人；男8 例，女12 例；其中合并糖尿病18 例，高血压16 例，高血脂15 例，免疫力较差，生活习惯不良。

2.2 诺如病毒检出结果 通过RT-qPCR 检测，诺如病毒阳性检出率为83.3%(25/30)，且均为GⅡ，其中患者检出率为100.0%(20/20)，无症状工作人员为50.0%(5/10)。选取Ct 值≤30 的20 份标本，提取的核酸经普通RT-PCR 扩增后，产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳，18 份标本在557 bp 处可见特异性片段，大小与预期相符，部分扩增阳性标本见图1。

图1 部分扩增阳性条带

2.3 序列分析和系统进化树分析 将RT-qPCR 检出的18 份标本的产物进行测序，测序成功16 条，诺如病毒在线分型工具结果显示引起此次疫情暴发的型别有两种：GⅡ.P16-GⅡ.4 Sydney2012(68.75%，11/16)和GⅡ.3-GⅡ.P12(31.25%，5/16)；同源性分析发现，各条序列间核苷酸同源性高达98%。将16 条序列与从GenBank 数据库下载的诺如病毒参考株进行比对，分别建立RdRp 区和VP1 区进化树，表明11 条GⅡ.P16 与MT501844.1(西班牙株)同源性较高，属于同一个进化分支，5 条GⅡ.P12 与MT127358.1 GⅡ(韩国株)处于同一分支，亲缘性较高，见图2；11条GⅡ.4 Sydney2012 与MW205667.1(北京株)同源性较高；5 条GⅡ.3 与MH842259.1(浙江台州株)处在同一分支，见图3。

图2 南通地区16 株诺如病毒与10 条参考株(国外)RdRp 区进化树

图3 南通地区16 株诺如病毒与10 条参考株(国内)VP1 区进化树

3 讨论

诺如病毒主要通过粪口途径传播，传染性极强，主要发生在人口密集的公共场所或半封闭环境，如学校、养老院、托幼机构。全年均可发病，但具有较明显的季节性，寒冷季节高发，因此又被称为“冬季呕吐病”，北半球高发时间为10 月～次年3 月，南半球是4～9 月。人群普遍易感，可累及任何年龄，尤其是免疫力低的儿童和老年人。患者、隐型感染者、健康带菌者均可成为传染源。此次诺如病毒暴发疫情，经现场流行病学调查，排除水源性和食源性感染的可能，考虑传播方式为人与人近距离接触和气溶胶传播。由该病毒导致的急性胃肠炎多呈自限性，成人多数表现为腹泻，儿童表现为呕吐。

在众多的基因型中，GⅡ.4 依靠自身较强的变异能力以及高变区位于病毒衣壳表面多变的免疫识别受体相互作用的功能，属于Nov 优势基因型，其不同的变异亚型在各自的变异环境中具有更高的感染性[5]。该型别常引起世界范围的大暴发，每隔2～3 年出现1 个新的变异株，并在世界范围内引起大流行[6]。GⅡ.4 Sydney2012 是2012 年首次在澳大利亚悉尼被发现的，随后在我国多省份被相继报道并成为主要流行亚型，充分说明了GⅡ.4 全球流行的特点和持续突变的适应能力[7]。最近的研究[8-9]表明GⅡ.P16-GⅡ.4 Sydney2012 是由GⅡ.2 型和GⅡ.4 Sydney2012 株重组后形成的新的重组株，重组发生在GⅡ.P16 RdRp 基因。GⅡ.P16 在人群中具有低传播的优势，可以逃脱固有免疫而达到在人群中广泛流行的目的[10]。

本次调查中，在采集的10 份无症状感染中检出诺如病毒阳性5 份，基因型均为GⅡ.P12-GⅡ.3，但均未表现出明显的胃肠道症状，这可能与中青年免疫力相对较强有关。GⅡ.P12-GⅡ.3 属于常见的重组类型，在江苏镇江、无锡均有报道，是引起北京和武汉儿童腹泻病检测中最多的重组类型，分别占非GⅡ.4 重组类的54.2%和54.9%[11-12]。该型别主要出现在亚太地区，如日本、韩国、中国等[13]，本研究也发现了这种重组类型且与韩国株同源。GⅡ.3-GⅡ.P12毒株在2009—2015 年均有发现且多发生在青少年群体中。机构工作人员社会活动面广，人员接触多，流行病学调查时其中一名工作人员回忆后说自家小孩在数日前出现呕吐、腹泻症状，但未引起注意，也未有效处理呕吐物导致自身感染，也是造成本重组株暴发的直接原因。

诺如病毒的基因组经常在ORF1 区和ORF2 区发生重组，这导致诺如病毒的遗传分化更大，因此，RdRp 和衣壳蛋白的基因型可能因重组而不同。诺如病毒易变异，存在多种抗原类型和基因型，出现的重组株更表现出抗原的多样性，易引起疫情暴发。2014年之前，全球范围内诺如病毒暴发的基因型多为GⅡ.4 型，近年来主要流行亚型为GⅡ.4 Sydney2012，本次调查检出11 条该型别且已经形成独立的分支，未来很有可能继续流行，应加强监测。

近年来，由诺如病毒引起的急性胃肠炎病例报道逐渐增多，这可能与诺如病毒抗原漂移和基因重组的方式进化有关[14]，本次测序结果显示在一起暴发疫情中检出两种重组基因型，充分说明了诺如病毒变异频繁的特点。

由诺如感染引起的急性暴发疫情多数是由于呕吐物未得到及时有效的处理，造成气溶胶传播。本次调查的是发生在养老机构的暴发疫情，首例患者呕吐后未第一时间消毒，而仅做简单的清扫拖地处理，给病毒传播创造了条件，同时也与老年人免疫力低下、卫生习惯不良以及环境封闭有关，应加强人员管理，减少流动，加强健康宣传教育。