烤烟全生育期覆膜栽培对植烟土壤理化性质及细菌群落结构的影响

郭 冲，曾淑华，刘雅洁，杨懿德，杨 洋，鄢 敏，陈佛源，韩 伟，刘 雷

（1.四川农业大学农学院，四川 成都 611130；2.四川省烟草公司宜宾市公司，四川 宜宾 644600）

【研究意义】土壤微生物在养分循环、有机质分解、土壤肥力维持和改善、土传病虫害防治等方面发挥着重要作用［1-3］。【前人研究进展】前人研究表明，植烟土壤微生物群落结构与土壤理化性质和养分含量密切相关［4-5］，这可能是导致青枯病［6-8］等一系列田间病害的原因。随着分子生物学技术的发展，宏基因组学已成为研究微生物种群动态的有力工具。高通量测序技术打破了传统培养方法的局限性，可以全面分析微生物总DNA，灵敏、快速的检测环境样品中微生物群落结构及其多样性［9-11］。王亚月等［12］通过高通量Illumina MiseqTM 宏基因组16S rDNA 测序，研究了4 种生防菌对烟草黑胫病的防治效果及对根际土壤微生物群落结构的影响。张艺洁等［13］利用宏基因组16S rDNA 测序技术获得了烟草根际土壤中丰富的细菌信息，结果表明细菌多样性水平较高，不同样品间主要细菌群落结构分布相对稳定。以上研究表明基于宏基因组学研究土壤微生物群落结构的技术日趋成熟。

覆膜栽培是一项在全球范围内应用广泛的农业技术，具有直接的经济和环境效益，如提高作物产量和改善品质、提高水分利用率、改善土壤质量、减少温室气体排放和硝酸盐流失等功效［14］。对土壤微生物的影响方面，有研究表明烤烟覆膜栽培有利于土壤微生物的积累，可显著增加土壤微生物的数量［15］。另有研究指出，地膜覆盖可轻微增加丛枝菌根真菌（AMF）和细菌的多样性［16］，但对氨氧化细菌的多样性没有影响［17］。一项为期28 年的研究表明，地膜覆盖增加了变形菌门（Proteobacteria）和放线菌门（Actinobacteria）的相对丰度［18］。然而，Luo 等［19］通过对土壤微生物群落的磷脂脂肪酸（PLFA）分析发现，覆膜处理使PLFAs 总量显著降低了21.5%，真菌、细菌和放线菌的绝对丰度分别降低了26.7%、23.1%和24.6%。综上，覆膜栽培对烟草土壤微生物数量和群落结构的影响仍存在一定争议。【本研究切入点】烤烟栽培通常需要适时揭膜，但在一些较高海拔的冷凉烟区，全生育期覆膜栽培技术也有一定推广。孔德钧等［20］、杨春江等［21］的研究表明，在高海拔（1 800 m）、多雨烟区进行全生育期覆膜栽培可增加烤烟的产值量。目前，关于全生育期覆膜栽培技术的相关研究较少，对这种栽培模式下土壤理化性质和微生物群落结构变化的研究也几乎缺失。【拟解决的关键问题】为进一步解决高海拔冷凉烟区烤烟生长中后期温度不足、暴雨冲刷导致的严重水土流失等问题，本研究通过全生育期覆膜栽培的方式有效避免了以上问题，并明确其对植烟土壤理化性质及细菌群落结构的影响，可为烤烟覆膜栽培技术的完善成熟提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验地概况及试验设计

试验于2020 年4—9 月在宜宾市兴文县仙峰苗族乡群鱼社区（28°23′67″N、105°05′94″E，海拔1 153.6 m）开展。供试烟草品种为云烟87，烟苗于2020 年4 月16 日移栽，9 月10 日采收完毕。设置1 个对照（CK）：白色地膜覆盖，并于移栽后50 d 揭膜；3 个处理（整个生育期均不进行揭膜）：（1）白色地膜覆盖（BY）；（2）黑色地膜覆盖（HY）；（3）黑白双色地膜（中间1/3 白色，两边各1/3 黑色）覆盖（SY）。采用随机区组设计，设置3 次重复，小区面积为66.7 m2，植烟110 株，行株距为1.1 m×0.55 m。根据当地优质烟叶生产技术，以烟草专用复合肥（600 kg/hm2）和过磷酸钙（200 kg/hm2）作为基肥施入；在移植30 d 后，以90 kg/hm2的硝酸钾（m［N］∶m［K2O］=1∶3.3）作第一次追肥施入；在移栽50 d 后，以200 kg/hm2的硫酸钾作第二次追肥施入。

1.2 试验方法

1.2.1 烟叶和土壤取样及测定 按照GB 2635－1992 对初烤烟叶进行分级，并记录上、中、下等级烟叶质量，按照当地收购价计算均价和产值［22］。在揭膜后每隔5 d 使用地温计（创纪美CJM-367）进行一次测温，测温时间为每天的8：00、14：00、20：00，并以公式T=（2T14+T8+T20）/4计算当天的平均温度。土壤含水率的测定使用烘干称重法进行，在揭膜后10、20、30、40、50 d用土钻分别收集0～10、10～20 和20～30 cm 的土层土样，运回实验室烘干、称重和测量，平均含水量的计算公式为W=（W10+W20+W30）/3。在烤烟成熟采收结束时，使用五点取样法（每点3株）从每个小区15 株烟根部收集土壤样本。首先去除土壤表层0～5 cm 土样，将烟株连根挖起并轻摇根系周围的土壤，然后将附着在根部表面的土壤作为根际土壤进行取样。田间收集的土样立即密封到制冷管中，并放入液氮罐中保存。冷冻的土样被运送到实验室后，立即通过2 mm 土筛过筛，以清除碎片和石头。其中，一些土样用于16S rDNA 测序分析，一些土样置于室内风干（48 h）、碾磨，并用于土壤理化性质分析，其余土样放入液氮罐中备存，直到确定土壤理化性质和细菌群落结构。土壤pH 值、有机质、全氮、全磷、全钾和碱解氮、有效磷、速效钾等含量的测定参照文献［23-24］。

1.2.2 细菌16S rDNA 测序 使用土壤DNA 快速自旋试剂盒（MP Biomedicals，anta Ana，CA，USA）和FastPrep FP120 细胞干扰器（Qbiogene，Canada）从0.5 g 新鲜土样中提取微生物总DNA。将提取的DNA 溶解在50 μL 的TE 缓冲液中，并立即在-20 ℃环境中冷冻，再进一步分析。使用引物319 F（5-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3）和806 R（5-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3），以12 个样本的总DNA 为模板对细菌16S rRNA的V3-V4 区域进行扩增。PCR 在热梯度循环器（Eppendorf，Hamburg，Germany）中进行，98 ℃初始变性30 s，随后继续在此温度下进行35 个周期循环，每周期持续10 s，52 ℃条件下退火30 s，72 ℃延伸45 s，并在此温度下最终延伸10 min，通过2%的琼脂糖凝胶电泳确认PCR 产物。

1.3 数据统计与分析

利用 Excel、Canoco（4.5）软件、R 语言统计软件和SPSS（24.0）数据处理系统对数据进行统计分析，并利用Duncan’s新复极差法和皮尔逊积差相关进行数据的多重比较和相关性分析。分类操作单元（OTU）被定义为一组具有相同限制条件的序列，采用QIIME［25］方法估算细菌多样性指数：

式中，Sobs和N分别表示库中OTU 的总数和克隆的数量，pi=ni/N。根据Chao［26］描述的方法确定稀有度、非参数丰度指数和偏差校正的物种丰度估计值。

采用线性判别分析（LDA）效应量法（LEfSe）对各处理间丰度有显著差异的细菌类群进行鉴定。在LEfSe 分析中使用Kruskal-Wallis（KW）和秩检验（α=0.05）检测特定类群之间显著不同的特征丰度，然后使用线性判别分析来估算每个差异丰度的效应大小（LDA＞2.0）。此外，为防止冗余数据的干扰，本研究对分类级别从定义域到属进行了限制。

2 结果与分析

2.1 全生育期覆膜对烤烟经济性状的影响

由表1 可知，全生育期不同颜色地膜覆盖处理的产量和产值均显著优于对照（CK），在均价和中上等烟比例上，双色地膜覆盖（SY）处理明显优于对照和其他处理。产量上，双色、黑色、白色地膜覆盖处理分别较对照增产13.33%、18.24%、21.36%；产值上，双色、黑色、白色地膜覆盖处理分别较对照增值20.26%、15.87%、13.28%。综上，和揭膜处理相比，全生育期覆膜处理可显著提高烤烟的产值量，地膜颜色以黑白双色膜最优。

表1 不同覆膜处理对烤烟经济性状的影响Table 1 Effects of different film mulching treatments on economic characters of flue-cured tobacco

2.2 全生育期覆膜对植烟土壤理化性质的影响

成熟期，不同覆膜处理植烟土壤理化性质分析表明，各项土壤理化性质指标在不同处理和对照间均存在显著差异，全生育期地膜覆盖显著提高了土壤温度、全钾和全磷含量，分别较对照提高1.62%～4.11%、0.70%～5.58%和3.11%～27.33%，降低了土壤pH 和碱解氮含量，分别降低3.02%～4.80%和10.45%～14.50%。此外，白色地膜覆盖处理（BY）的土壤有机质、总氮、有效磷、速效钾等指标均显著低于CK 和其他处理，土壤含水量则表现相反（表2）。

表2 不同覆膜处理下植烟土壤基本理化性质差异Table 2 Basic physicochemical properties of tobacco-planting soil under different film mulching treatments

为进一步阐明全生育期地膜覆盖对植烟土壤的影响，我们还分析了不同覆膜处理土壤中、微量元素含量的差异。结果表明，与CK 相比，各覆膜处理土壤的全铁和有效铜含量显著增加，增幅分别为1.73%～4.81%和4.76%～19.05%，有效铁、全铜和全锌含量则显著降低，降幅分别为3.36%～13.43%、2.25%～9.32%和7.69%～10.01%。此外，双色地膜覆盖（SY）处理的有效锌含量最高，黑色地膜覆盖（HY）处理的有效钙和有效硫含量最高，白色地膜覆盖（BY）处理的有效镁、有效氯和有效硼含量显著高于CK 及其他处理（表3）。

表3 不同覆膜处理下植烟土壤中、微量元素含量差异Table 3 Content differences of trace elements in tobacco-planting soil under different film mulching treatments

2.3 全生育期覆膜对植烟土壤α 多样性的影响

α 多样性是指一个特定环境或生态系统的多样性，主要通过Chao1、Observed species、Goods_coverage、Shannon、Simpson 等指数来反映物种丰富度和均匀度以及测序深度。Chao 1、Observed_species 指数主要反映样本的物种丰富度信息；Goods_coverage 指数反映样本的低丰度特征值覆盖情况；Simpson、Shannon 指数主要体现物种的丰富度和均匀度。各覆膜处理和CK 在Shannon或Simpson 指数上差异不显著。CK 的OTU 数及Chao 1 指数显著高于其他处理，其中CK 的Chao 1 指数分别比白色（BY）、双色（SY）、黑色地膜覆盖（HY）处理高14.09%、24.20%、24.81%，表明地膜覆盖可不同程度地抑制植烟土壤中细菌的丰富度，但对均匀性无明显影响。各覆膜处理和CK 的覆盖度指数均大于99%，可准确反映样本的真实情况。HY 处理的覆盖度指数显著高于CK，但与BY 和SY 处理无明显差异，表明HY 处理较CK 能显著提高物种低丰度覆盖度指数（表4）。

表4 不同覆膜处理对植烟土壤α 多样性的影响Table 4 Effects of different film mulching treatments on α diversity in tobacco-planting soil

2.4 全生育期覆膜对植烟土壤细菌群落结构的影响

根据Illumina 平台的测序结果，本研究选择了相对丰度最高的10 个菌门进行分析。结果表明，变形菌门（Proteobacteria）、酸杆菌门（Acidobacteria）、绿弯菌门（Chloroflexi）、放线菌门（Actinobacteria）、芽单胞菌门（Gemmatimonadetes）和浮霉菌门（Planctomycetes）6 种菌门的相对丰度在对照和各地膜覆盖处理中均较高，且占总的OTUs 80%以上（图1）。

图1 不同覆膜处理下根际细菌门水平相对丰度Fig. 1 Relative abundance of rhizosphere bacteria in different film mulching treatments at the phylum level

热图反映了各土壤样本中优势菌属的相对丰度，我们将各分类水平相对丰度最高的30 个群落组成数据依照分类单元的丰度分布或样本间的相似程度加以聚类，根据聚类结果对分类单元和样本分别进行排序，并通过热图（图2）加以呈现。由图2 可知，CK 的优势菌属为Haliangium、嗜酸栖热菌属（Acidothermus）、芽单胞菌属（Gemmatimonas）和MND1；白色地膜覆盖（BY）处理的优势菌属为全噬菌属（Holophaga）、分枝菌属（Ramlibacter）、Ellin6067和慢生根瘤菌属（Bradyrizobium）；双色地膜覆盖（SY）处理的优势菌属为硝化螺菌属（Nitrospira）、Bryobacter、罗河干菌属（Rhodanobacter）、Candidatus_Solibacter、RB41、Candidatus_Udaeobacter和Reyranella；黑色地膜覆盖（HY）处理的优势菌属为芽单胞菌属（Gemmatimonas）、MND1、鞘氨醇单胞菌（Sphingomonas）和Chujaibacter。

图2 不同覆膜处理根际细菌群落属水平的层次聚类热图Fig. 2 Hierarchically clustered heatmap of rhizosphere bacterial communities under different film mulching treatments at the genus level

通过LEfSe 分析明确了3 个处理组（BY、HY、SY）和对照组（CK）的差异类群。在细菌属水平上，白色（BY）、黑色（HY）和双色地膜覆盖（SY）处理分别筛选出15 个、1 个和23个主要差异类群。随后又到这3 个处理筛选出的差异类群中去筛选其共有类群，以求找到各处理对植烟土壤理化性质影响较大的特征菌属。结果表明，3 个处理不存在相同的共有菌属，但从白色（BY）和双色地膜覆盖（SY）处理的类群中筛选出了3 个共有类群（表5），且这3 个类群菌均属于变形菌门（Proteobacteria）、分属于鞘脂单胞菌科（Sphingomonadaceae）、伯克霍尔德菌科（Burkholderaceae）、黄单胞菌科（Xanthomonadaceae）。

表5 BY 和SY 处理共有菌属类群Table 5 Common rhizosphere bacterial community indicators of BY and SY

2.5 细菌群落与土壤理化性质关系

通过冗余分析，我们发现细菌群落与土壤理化性质之间存在显著联系。箭头长度代表因素影响效果：箭头越长，影响效果越大；箭头间的角度表明各因素间的相关性：锐角表明两因素呈正相关关系，钝角则表示负相关。由图3 可知，基本理化性质中的土壤温度（Tem）和碱解氮（A-N）以及中、微量元素中的有效铁（A-Fe）、总铁（T-Fe）、有效铜（A-Cu）和总铜（T-Cu）是影响细菌门水平上群落结构的主要因素。图3A中冗余分析的前两个轴解释了土壤细菌门水平上群落结构与基本理化性质之间66.93%的变异，RDA 1 解释了48.72% 的变异，RDA 2 解释了18.21%的变异。图3B 中冗余分析的前两个轴解释了土壤细菌门水平上群落结构与中微量元素之间64.66%的变异，RDA 1 解释了37.63%的变异，RDA 2 解释了27.03%的变异。

图3 细菌群落和土壤理化性质间的冗余分析Fig. 3 Redundancy analysis (RDA) between bacterial communities and soil physicochemical properties

3 讨论

3.1 全生育期覆膜栽培对烤烟经济性状的影响

生态环境决定烟叶质量特色，土壤、海拔及气候等环境条件是影响烤烟产质量的重要因素。王全贞等［27］认为在海拔落差较大、降雨和气温差别较大、立体气候明显的烟区常年种植单一品种会面临烤烟品种退化、病害加剧、产质量下降等问题。宜宾烟区作为典型的丘陵烟区，同样面临着海拔落差较大，立体气候明显等问题。因此，覆膜栽培作为一种可有效改善植烟土壤温度、水分等田间小气候的栽培措施，在当地被广泛推广应用。大量研究表明，地膜覆盖栽培需在烤烟移栽后30～60 d 左右进行揭膜培土［28-29］。但也有研究指出，在高海拔、多雨烟区进行全生育期覆膜栽培对烤烟的生长发育及产值量是有利的［20-21］。本研究通过对比全生育期不同颜色地膜覆盖处理和白色膜覆盖适时揭膜对照间经济性状的差异，发现全生育期覆膜能显著提高烤烟的产值量，这与孔德钧等［20］研究结果一致，其开展研究的烟区为贵州威宁县，海拔高度为1 800 m 左右，烤烟品种为红花大金元，本研究选择的烟区为四川兴文县，海拔高度为1 150 m 左右，烤烟品种为云烟87，自然气候、土壤类型及烤烟品种不同等因素可能是两者海拔相差较大，却得出一致结论的重要原因。

3.2 全生育期地膜覆盖对植烟土壤理化性质的影响

土壤是影响烟叶生长的重要生态条件之一，土壤质量是生产优质烟草的重要基础，植烟土壤的理化性质将直接影响烟叶的产质量［30］。地膜覆盖会显著改变土壤湿热特性、物理和化学环境，进而影响土壤元素的形成。本研究中，与揭膜对照（CK）相比，不同颜色覆膜处理可提高植烟土壤温度，白色（BY）、双色（SY）和黑色地膜覆盖（HY）处理的平均温度分别上升0.99 ℃、0.62 ℃和0.39 ℃。此外，使用白色地膜覆盖会提高土壤表层含水率（0～10 cm），而使用双色和黑色地膜覆盖则会降低土壤表层含水率。这可能是由于白色地膜覆盖处理增温较高，导致深层土壤的水分蒸发加剧，然后在土壤表层遇塑料膜后冷凝回流形成，这说明地膜覆盖会改变土壤小气候（温度和水分），进而影响土壤pH 值、有机物及其他养分循环。另有研究指出，地膜覆盖对水土流动性较大土壤中的碱解氮和速效钾具有富集作用［31］，这支持了Zhou 等［32］关于地膜覆盖有利于玉米吸收土壤养分的发现。本试验中，地膜覆盖显著增加了烟草成熟期植烟土壤中的总磷和总钾含量，并显著降低了碱解氮含量，这与前人的研究存在一定差异。本研究中，与对照组相比，黑色地膜覆盖处理的土壤碱解氮和速效钾在整个生育期呈下降趋势，而有效磷则表现相反。有趣的是，也有研究表明，黑色地膜覆盖可一定程度减少土壤中的碱解氮、有效磷和速效钾［33］，这与本研究的结论相似。综上，覆盖物的颜色、覆盖时间和作物类型对土壤养分含量的影响并不一致。

3.3 全生育期覆膜对细菌群落结构的影响

土壤微生物被广泛用作衡量土壤质量的生物指标，细菌则是最丰富和多样化的土壤微生物群体。在Maul 等［34］的研究中，土壤物理特性、养分有效性和覆盖的塑料薄膜的变化会导致土壤微生物群落发生改变。本研究中，全生育期覆膜显著降低了细菌群落的相对丰度（表4），这与在其他作物如玉米［19］、水稻［35］上的研究相一致。此外，在细菌门和属水平上，对照和各处理间的优势菌群也存在显著差异。

土壤微生物群落的组成和分布受到土壤环境的影响，因此可以将其视为土壤质量变化的重要参考［36］。为明确植烟土壤环境对微生物群落结构的影响，找出烟草根际细菌群落结构与土壤环境因素之间的联系，我们将微生物群落与各土壤环境因子进行了冗余分析（RDA）。前人研究表明，土壤碱解氮、有机物、pH 值和含水量是影响烟草根际土壤细菌群落的重要环境因素，但本研究结果表明，土壤温度和碱解氮以及中微量元素中的有效铁、总铁、有效铜和总铜含量是影响细菌门水平上群落结构的主要因素，这与前人的研究结果存在一定差异。造成这种差异的原因很可能是本研究采用了全生育期覆膜栽培，而前人的研究是在烤烟生长中期适当时候进行了揭膜处理。

4 结论

全生育期覆膜栽培改变了植烟土壤理化性质，进而影响了土壤微生物群落的结构和丰度。本研究结果表明，全生育期覆膜可显著提高烤烟产值量，产量和产值分别较对照提高了13.33%～21.36%和15.87%～20.26%，经济性状最好的处理是黑白双色膜覆盖。在土壤理化性质方面，全生育期覆膜可提高土壤温度（1.62%～4.11%）、全钾（0.70%～5.58%）、全磷（3.11%～27.33%）、全铁（1.73%～4.81%）和有效铜（4.76%～19.05%）含量，降低土壤pH 值（3.02%～4.80%）、碱解氮（10.45%～14.50%）、有效铁（3.36%～13.43%）、全铜（2.25%～9.32%）和全锌（7.69%～10.01%）含量。在细菌群落结构方面，全生育期覆膜明显抑制了植烟土壤细菌的相对丰度，对照的Chao 1 指数分别比白色、双色、黑色地膜覆盖处理高14.09%、24.20%、24.81%。冗余分析结果表明，影响细菌门水平上群落结构的主要理化因子为土壤温度、碱解氮、有效铁、总铁、有效铜和总铜含量。