血浆长链非编码RNA LOC146880作为预测晚期非小细胞肺癌患者免疫治疗疗效的生物标志物研究

戴隆妹 杨力宝

【摘要】  目的    探讨长链非编码RNA LOC146880是否可作为评估晚期非小细胞肺癌（NSCLC）患者接受肿瘤免疫治疗的临床预后生物标志物。方法    纳入接受肿瘤免疫治疗的42例晚期NSCLC患者作为试验组，根据ROC最佳截断值将基线Inc RNA LOC146880表达分为高、低表达组，另外选择同期42例肺部良性疾病患者作为对照组。研究终点是根据RECIST标准评估晚期NSCLC患者的缓解率（RR）、无进展生存期 （PFS） 和总生存期（OS）。结果    试验组的Inc RNA LOC146880表达水平显著高于对照组；在临床相关性分析中，Inc RNA LOC146880表达与肿瘤转移部位的数量显著相关；在纳入的42例晚期NSCLC患者中，总体RR为39.2%；在20.5个月的中位随访之后，相较于Inc RNA LOC146880高表达组，Inc RNA LOC146880低表达组的RR显着增高，PFS显著增长，OS也显著增长。结论    接受肿瘤免疫治疗的晚期NSCLC患者，Inc RNA LOC146880低表达预示着较好的临床预后。血浆长链非编码RNA LOC146880可作为预测晚期NSCLC免疫治疗疗效的生物标志物。

【关键词】  非小细胞肺癌； lnc RNA； 免疫治疗

中图分类号：R392；R734.2        文献标识码：A

文章编号：1672-1721（2023）26-0044-03

DOI：10.19435/j.1672-1721.2023.26.014

肿瘤免疫治疗是非小细胞肺癌（NSCLC）治疗中最重要的突破之一，目前迫切需要筛选能预测NSCLC患者的肿瘤免疫治疗疗效的生物标志物。高突变的肿瘤负荷（TMB）曾被报告为潜在的预测免疫治疗疗效的生物标志物之一[1]。然而，缺乏标准化的检测和评估手段限制了TMB作为常规临床标志物的应用[2]。最近，由中性粒细胞与淋巴细胞比值（NLR）和乳酸脱氢酶（LDH）的联合应用推出的肺免疫预后指数（LIPI）评分被提议作为免疫治疗疗效的血液生物标志物之一，但由于来自多中心的回顾性研究[3]和RCT研究[4]得出的相反结果，因此该评分仍存在争议。在本研究中长链非编码RNA （Inc RNA）评估了晚期NSCLC患者在接受免疫治疗前血液LOC146880的表达水平与临床获益之间的关联，旨在研究Inc RNA LOC146880是否可作为预测晚期NSCLC患者免疫治疗疗效的生物标志物。

1    研究对象与研究方法

1.1    研究对象和研究终点    连续收集2018年12月—2021年12月期间就诊于三明市第二人民医院的肿瘤科且接受肿瘤免疫治疗的NSCLC 晚期患者（n=42），作为试验组，纳入同期42例肺部良性疾病患者作为对照组。收集2组人群的外周血血浆样本，以上84名研究对象均签署知情同意书，本研究通过该院医学伦理委员会审批。研究终点：主要终点为缓解率（response rate，RR），根据实体瘤疗效评价新标准RECIST评估RR；次要终点为无进展生存期（progression-free survival， PFS）和总生存期（overall survival，OS）。

1.2    试验方法 试验方法具体如下。

1.2.1    血浆RNA提取 将2组研究对象的冻存血浆于4 ℃冰上自然融化，通过离心机（4 ℃，12 000 xg）离心沉淀血浆杂质；750 μL TRIzol LS裂解液裂解后，静置5 min，依据血浆RNA 提取试剂TRIzol LS （Life公司）的说明书，抽取10 μL RNA。

1.2.2    引物合成    通过在线数据库NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）查询Inc RNA LOC146880和GAPDH的序列，然后根据所获得的序列在Primer 6.0中生成引物。Inc RNA LOC146880引物序列的正向为5'-AACTAAGGCACGGTCAACTATCA-3'，反向为5'-GGAAACTTTGGCTTTAAAACGA-3'；内参基因为GAPDH，引物序列的正向为5'-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3'，反向为5'-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3'，以上引物均由上海生工生物公司合成。

1.2.3    实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）检测    Inc RNA LOC146880表达水平参照使用SuperScript Ⅱ逆转录酶试剂盒 （Invitrogen）说明书将RNA逆转录为cDNA，以cDNA为模板进行qRT-PCR扩增反应，使用SYBR Green方法在ABI 7500序列检测系统（Applied Biosystems）上测量通过qRT-PCR确定的相对RNA水平。

1.3    统计学方法    采用SPSS 22.0统计学软件分析数据，计数资料以百分比表示，采用χ2检验，Mann-Whitney 检验或Fisher 精确检验，计量资料以x±s表示，采用t检验，多因素分析采用COX回归分析， P<0.05为差异有统计学意义。

2    结果

2.1    患者的基线特征    连续入组42例接受肿瘤免疫治疗的晚期NSCLC患者基本资料见表1。患者年龄35～86岁，中位年龄70.5岁，其中24例患者（57%）≥65岁，18例患者（43%）<65岁；28例患者 （67%） 为男性，14例患者（33%）为女性；16例患者（38%）病理类型为鳞癌，26例患者（62%）病理类型为腺癌；22例患者（52%）出现1～2个肺外转移部位，20例患者（48%）出现≥3個肺外转移部位；27例患者（64%）有既往胸部放疗史，15例患者（36%）无既往胸部放疗史，见表1。

2.2    血浆Inc RNA LOC146880的表达及与患者临床病理特征的相关性分析    与对照组比较，试验组血浆Inc RNA LOC146880表达水平较高（P<0.05），见表2。进一步研究表明Inc RNA LOC146880表达仅与肿瘤转移部位的数量有关（P<0.05），与年龄、性别、吸烟史、病理类型、BMI 、合并症、脑转移、肝转移、胸腔积液、胸部放疗史、类固醇使用史均无关（P>0.05），见表3。

2.3    总体疗效及不良反应、缓解率（RR）、无进展生存期（PFS）、总生存期（OS）    研究发现，42例晚期NSCLC患者总体RR为39.2%，18个患者出现缓解（15個PD和3个CD）和7个患者出现SD。在47%（20/42）患者中观察到免疫相关不良事件，其中常见的是肺炎（n=5，11.9%）、甲状腺功能障碍（n=3，7.14%）、虚弱（n=3，7.14%）。在短期停止免疫治疗和大剂量类固醇治疗后，所有肺炎均治愈，但是出现1例3级肝炎与疾病进展同时发生，因此停止治疗并给予类固醇直至消退。与Inc RNA LOC146880高表达组相比，Inc RNA LOC146880低表达组患者显示出更高的RR，更长的PFS，更长的OS（P<0.05）。

3    讨论

肺癌是世界上最常见的癌症（占总病例数的 11.6%），也是癌症死亡的主要原因（占癌症死亡总数的18.4%）[5]。NSCLC属于肺癌的常见类型之一，近1/3肺癌患者为非小细胞肺癌[6]，对患者身心健康和家庭负担影响较大，且由于临床上尚缺乏有效的筛查手段和早诊治的方法， 绝大多数患者确诊时已是晚期[7]。20世纪90年代以来，随着肿瘤免疫学和分子生物学的飞速发展，研究者发现肺癌的发生发展与肿瘤组织的基因突变以及患者的免疫失衡有着密切的联系[8]。同时，肿瘤微环境中的免疫细胞和肿瘤细胞之间存在复杂“博弈”关系。肺癌的免疫治疗成为肺癌多学科治疗中新的研究方向和应用热点，日益受到重视，值得进一步探索。然而，对于临床上接受肿瘤免疫治疗的患者，目前仍缺少有效的临床疗效预测生物标志物。因此需通过研究肺癌的免疫微环境，进而找到可靠的生物标志物，指导临床上有效地筛选肺癌免疫治疗适宜患者。lnc RNA是一类具有 200 个或更多核苷酸的非编码转录物。lnc RNA作为一种新兴的肿瘤标志物，在肿瘤的诊断和治疗中具有重要价值。随着高通量测序技术的发展，lnc RNA在人类肿瘤发生发展过程中的作用逐渐引起关注[9]。目前已有研究表明lnc RNA参与肿瘤发生发展的一系列病理生理过程，包括细胞增殖、凋亡、细胞迁移侵袭、细胞周期等，有望作为肿瘤免疫治疗新的有效生物标志物[10]。对于肺癌的研究，越来越多的证据也表明，lncRNA作为癌基因或抑癌基因表达的标志物而参与了肺癌的发生[11]。之前的研究表明，Inc RNA LOC146880作为染色体17q24.3上的一个lnc RNA，在肿瘤组织中的表达高于在邻近正常组织中，高表达与NSCLC的预后不良有关[12]。有学者进一步研究发现NSCLC中Inc RNA LOC146880的表达与患者生存结果相关，机制可能与Inc RNA LOC146880在肺肿瘤细胞中的高表达导致KPNA2下调以及细胞增殖、迁移和侵袭的抑制有关；此外Inc RNA LOC146880的转录活性也受启动子甲基化的影响[13]。本研究发现，晚期NSCLC患者血浆LOC146880表达与肿瘤转移部位的数量相关（P<0.05），说明Inc RNA LOC146880高表达参与晚期NSCLC癌变进展及转移；Inc RNA LOC146880较低表达的NSCLC患者的肿瘤免疫治疗效果较好，RR更高且有更长的PFS和OS。当Inc RNA LOC146880作为免疫治疗有效的生物标志物评估时，相比于其他侵入性检查如PD-L1和TMB，可能具有更好的临床预测价值，因为仅通过简单的血液样本就可以筛选出肿瘤免疫治疗中可能获益更多的部分患者。

综上所述，血浆Inc RNA LOC146880表达与NSCLC的发生密切相关，治疗前检测Inc RNA LOC146880表达水平有助于指导免疫治疗NSCLC，从而为临床治疗提供一定参考。目前临床对Inc RNA LOC146880在NSCLC发生发展中的分子机制仍然缺乏了解，今后需要对Inc RNA LOC146880在NSCLC进展过程中的分子机制进行深入探究，以支持抗Inc RNA LOC146880单克隆抗体的研发。另外，本研究样本量较少，需要大范围进行验证，同时需要进行大样本、多中心的临床研究，以进一步证实本结论。

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