黄芩苷抑制Panx-1 和P2X7 的激活减轻副猪嗜血杆菌病血管内皮细胞损伤

2023-10-28周灵露付书林袁昱珍邱银生

湖北畜牧兽医 2023年5期

周灵露，付书林，袁昱珍，邱银生

（武汉轻工大学动物科学与营养工程学院，武汉 430023）

副猪嗜血杆菌（Glaesserellaparasuis，GPS）是一种嗜血杆菌科巴氏杆菌属的革兰氏阴性菌，纤维素性炎是其在临床上的重要病理特征，引起的炎症反应重且死亡率高，给养猪业带来巨大损失［1，2］。黄芩苷（Baicalin，BA）是具有清热解毒的天然药物黄芩的主要成分，因其具有抗菌、抗病毒、抗炎和抗氧化等多种生物活性而成为研究热点［3］。研究发现，黄芩苷能抑制脂多糖和副猪嗜血杆菌诱导的猪单核细胞和血管内皮细胞NF-κB、NLRP3 和MAPK 等信号分子的激活［4-7］，具有抗炎和抗凋亡作用，研究其对副猪嗜血杆菌血管屏障损伤的保护作用，对于挖掘黄芩苷在缓解副猪嗜血杆菌病的用途十分重要。本试验采取体外方法，研究副猪嗜血杆菌诱导对Panx-1 与P2X7 相关信号通路表达等的影响及黄芩苷的干预作用，以期探明Panx-1 与P2X7 在黄芩苷抗副猪嗜血杆菌病血管内皮屏障功能损伤的作用，为黄芩苷治疗副猪嗜血杆菌引起的炎症反应提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验细胞及细菌

副猪嗜血杆菌菌株为强毒型SH0165，血清型为5 型，细胞为猪髋血管主动脉细胞（PIVEC），由华中农业大学惠赠。

1.2 试验设计

采用细胞培养模型，选取P2X7 特异性抑制剂BBG（亮蓝）为对照药剂。①筛选BBG 最适浓度，抑制剂组试验设空白对照组、GPS 造模组和4 个不同浓度抑制剂组（1、5、10、20 μmol/L BBG）；②为探寻Panx-1 和P2X7 调控副猪嗜血杆菌损伤血管内皮细胞功能的分子机制以及黄芩苷的干预作用，试验分为6 个组，即空白对照组、GPS 造模组、GPS+低剂量黄芩苷处理组（终浓度为25 μg/mL）、GPS+中剂量黄芩苷处理组（终浓度为50 μg/mL）、GPS+高剂量黄芩苷处理组（终浓度为100 μg/mL）、BBG 处理组（终浓度为10 μmol/L）。初始细胞约为106个/mL，感染复数MOI均为1∶1，细胞先加入药物预处理2 h，再加入细菌共培养12 h。通过以上处理分析黄芩苷对GPS诱导PIVEC 后Panx-1、P2X7、NLRP3、Caspase-1基因以及细胞因子IL-1β、IL-18基因表达的变化，再分析黄芩苷对GPS 诱导PIVEC 后P2X7、NLRP3、IL-1β、IL-18 蛋白表达的变化。

1.3 细胞培养方法

提前准备好37 ℃水浴锅，于液氮中取出细胞冻存管后快速置于水浴锅中解冻。遵循无菌操作原则，吸取至EP 管中，1 200 r/min 离心7 min，弃掉上清液。取5 mL 10% RPMI1640 细胞完全培养基轻轻吹打重悬后转移至25 mL 细胞培养瓶中，静置于细胞培养箱中培养过夜或大于10 h 后换液。当显微镜下观察到细胞在瓶底覆盖率大于85%左右，无菌操作原则下，吸取并弃掉培养基，加入1～2 mL 磷酸缓冲盐溶液（PBS），轻晃瓶身润洗细胞。每瓶细胞加入1.5 mL 胰酶，轻晃瓶身，细胞培养箱中静置30 s 后加入1 mL 培养基，无菌台中吸取并弃掉胰酶培养基混合液。每瓶用10 mL 10% RPMI1640 细胞完全培养基重悬细胞后分装至2 个新的25 mL 细胞培养瓶中。

1.4 总RNA 的提取与反转录

使用RNAiso Plus（Total RNA 提取试剂，TAKARA 公司，批号为AKG0730A）充分裂解细胞。在每个样品管中加入5∶1 的三氯甲烷。离心取上清液，加入等体积异丙醇。离心取沉淀即为RNA。利用Nanodrop 2000 型（Thermo Fisher Scientific 公司）核酸蛋白紫外分光光度仪测定RNA 浓度和纯度，根据浓度测定值调平各样品的RNA 浓度。根据反转试剂盒说明书（HiScript 1ststrand cDNA Synthesis kit，诺唯赞生物科技股份有限公司，批号为027E2231EA）配制RNA 反转体系，加入配置的溶液1 后，轻轻吹打混匀，42 ℃反应2 min；加入溶液2 后，50 ℃反应15 min，85 ℃反应2 min，后4 ℃保温；产物可立即使用或者分装后保存于-80 ℃。

1.5 Q-RT PCR 分析

按TaqPro Universal SYBR qPCR Master Mix（诺唯赞生物科技股份有限公司），批号为7E68212）试剂盒使用说明配制Mix，然在96 孔板上点样，上机定量检测。每个待测样品都设置对应的β-actin 作为内参，基因表达的相对含量用2-△△Ct法分析计算。最终结果使用归一化法，把GPS 造模组归一，其他处理组与其进行比较。试验数据采用SPSS 22.0 统计软件进行单因素方差分析和Log Rank 检验，比较空白对照组与GPS 模型组之间的差异，药物处理组（包括不同浓度抑制剂）与GPS 模型组之间的差异。βactin、Panx-1、P2X7、NLRP3、Caspase-1、IL-1β和IL-18的mRNA 引物序列采用引物设计软件Primer 5 进行设计，并用NCBI 中Primer-BLAST 进行验证。引物序列如表1 所示。

表1 用于Q-RT PCR 分析的引物序列

1.6 细胞蛋白质提取

使用KGP2100 型凯基全蛋白质提取试剂盒（南京凯基生物科技发展有限公司），按照说明书和细胞量配置蛋白质裂解液，淹没并平铺于细胞上，放置冰上10 min 充分裂解各组细胞，使用细胞刮刀同方向刮下贴壁细胞，待无明显细胞印迹后，收集液体于预冷的1.5 mL EP 管中，4 ℃15 000 r/min 离心15 min，小心吸取上清液于新的预冷EP 管后涡旋离心；按照BCA 法测定蛋白质浓度［P0010 型BCA 蛋白质浓度测定试剂盒（增强型），上海碧云天生物技术有限公司］，并将各组样品蛋白质浓度按照最低样品浓度调整至统一浓度，按比例加入蛋白质上样缓冲液（武汉塞维尔生物科技有限公司，货号为CR2202160），100 ℃金属浴8～10 min，待冷却至常温后，于-20 ℃保存备用。

1.7 Westernblot测定

将制胶模具装配好，根据不同目的蛋白质分子量选择不同浓度的胶，制胶流程参考SDS-PAGE 彩色变性凝胶快速制备试剂盒说明书。每次向制胶器中加液时注意缓慢，切勿引入气泡；为了保证蛋白质条带清晰，电泳条件设置为60 V 50 min；120 V 40 min；采用半干转的转印方法，转印程序依据目的蛋白质分子量大小设置；5%BSA 溶液摇床孵育条带3 h；根据目的蛋白质选择不同的一抗，4 ℃冰箱内摇床孵育过夜；次日TBST 摇床漂洗3 次，每次8 min。加入一抗对应二抗，摇床孵育3 h；TBST 摇床漂洗3 遍，滤纸吸干后，浸泡显色液后可显色。使用Image J 软件分析各条带灰度值，得到蛋白质相对表达量并进行归一化处理。

2 结果与分析

2.1 P2X7 抑制剂BBG 的最适浓度筛选

如图1 所示，在GPS 的诱导下，猪血管内皮细胞中P2X7基因的表达量极显著上调（P＜0.01），当抑制剂BBG 的终浓度分别为5、10、20 μmol/L 时，P2X7基因的表达极显著下调（P＜0.01）；当抑制剂终浓度为1 μmol/L 时，与GPS 模型组相比，P2X7基因的表达显著下调；为筛选黄芩苷最合适浓度下抑制剂达到最佳效果，故试验后续选择BBG浓度为10 μmol/L。

图1 亮蓝对GPS 诱导后猪血管内皮细胞中P2X7 基因表达的影响

2.2 黄芩苷对GPS 诱导PIVEC 后Panx-1、P2X7基因表达的变化

黄芩苷对GPS 诱导PIVEC 后Panx-1、P2X7基因表达的变化如图2 所示。结果表明，在GPS 诱导下，猪血管内皮细胞中Panx-1、P2X7基因的表达极显著上调（P＜0.01），各梯度黄芩苷作用后，Panx-1、P2X7基因的表达极显著下调（P＜0.01），且随着黄芩苷浓度的增大，下调幅度增大。

图2 黄芩苷对GPS 诱导PIVEC 后Panx-1（a）、P2X7（b）基因表达的变化

2.3 黄芩苷对GPS 诱导PIVEC 后NLRP3、Caspase-1 基因表达的变化

黄芩苷对GPS 诱导PIVEC 后NLRP3、Caspase-1基因表达的变化如图3 所示。结果表明，在GPS 诱导下，猪血管内皮细胞中NLRP3基因的表达极显著上调（P＜0.01），而Caspase-1基因的表达显著上调（P＜0.05），各浓度梯度黄芩苷作用后，NLRP3、Caspase-1基因的表达极显著下调（P＜0.01），且随着黄芩苷浓度的增大，下调幅度逐渐增大。

图3 黄芩苷对GPS 诱导PIVEC 后NLRP3（a）、Caspase-1（b）基因表达的变化

2.4 黄芩苷对GPS 诱导PIVEC 后细胞因子IL-1β、IL-18 基因表达的变化

黄芩苷对GPS 诱导PIVEC 后细胞因子IL-1β、IL-18基因表达的变化如图4 所示。结果表明，在GPS 诱导下，猪血管内皮细胞中IL-1β、IL-18基因的表达极显著上调（P＜0.01），不同浓度黄芩苷作用后，IL-1β、IL-18基因的表达极显著下调（P＜0.01）。随着黄芩苷浓度的增大，2 个基因表达下调幅度增大。

图4 黄芩苷对GPS 诱导PIVEC 后IL-18（a）、IL-1β（b）基因表达的变化

2.5 黄芩苷对GPS 诱导PIVEC 后P2X7 蛋白质表达的变化

黄芩苷对GPS 诱导PIVEC 后P2X7 蛋白质表达的变化如图5 所示。结果表明，模型组与对照组相比，在GPS 诱导下，猪血管内皮细胞中P2X7 蛋白质的表达量极显著上调（P＜0.01），说明GPS 可以显著激活P2X7 靶点；各药物组与模型组相比，各浓度梯度黄芩苷及抑制剂BBG 作用后，P2X7 蛋白质表达量极显著下调（P＜0.01），说明黄芩苷对P2X7 靶点具有调控作用，可以抑制P2X7 靶点过度激活，从而抑制炎症。黄芩苷组与BBG 组相比，BBG 组处理的P2X7蛋白质表达量下调幅度最大，说明BBG 作为P2X7靶点特异性抑制剂，功能优于黄芩苷。

图5 黄芩苷对GPS 诱导PIVEC 后P2X7 蛋白质电泳图谱（a）和表达量（b）的变化

2.6 黄芩苷对GPS 诱导PIVEC 后NLRP3 蛋白质表达的变化

黄芩苷对GPS 诱导PIVEC 后NLRP3 蛋白质表达的变化如图6 所示。结果表明，模型组与对照组相比，在GPS 诱导下，猪血管内皮细胞中NLRP3 蛋白质的表达量极显著上调（P＜0.01），说明下游NLRP3 炎症小体被显著激活；GPS+50 μg/mL 黄芩苷处理能极显著下调NLRP3 蛋白质的表达量（P＜0.01），GPS+100 μg/mL 黄芩苷和GPS+BBG 组抑制剂处理能显著下调NLRP3 蛋白质的表达量（P＜0.05），说明黄芩苷对NLRP3 炎症小体具有调控作用，可以抑制NLRP3 炎症小体过度激活，从而抑制炎症。黄芩苷组与BBG 组相比，黄芩苷组对NLRP3 的抑制作用优于BBG，表明黄芩苷可以通过其他途径调节NLRP3炎症小体，实行多途径抗炎。

图6 黄芩苷对GPS 诱导PIVEC 后NLRP3 蛋白质电泳图谱（a）和表达量（b）的变化

2.7 黄芩苷对GPS 诱导PIVEC 后IL-1β 蛋白质表达的变化

黄芩苷对GPS 诱导PIVEC 后IL-1β 蛋白质表达的变化如图7 所示。结果表明，模型组与对照组相比，在GPS 诱导下，猪血管内皮细胞中IL-1β 蛋白质的表达量极显著上调（P＜0.01），说明GPS 诱导炎性因子大量释放，引起炎症反应；各药物组与模型组相比，GPS+50 μg/mL 黄芩苷、GPS+100 μg/mL 黄芩苷处理及GPS+BBG 组抑制剂处理能极显著下调IL-1β 蛋白质的表达量（P＜0.01），GPS+25 μg/mL 黄芩苷处理能显著下调IL-1β 蛋白的表达量（P＜0.05），说明黄芩苷与BBG 可以抑制炎性因子释放，从而抑制炎症，表明了P2X7 靶点的关键作用。

图7 黄芩苷对GPS诱导PIVEC后IL-1β蛋白质表达的变化

2.8 黄芩苷对GPS 诱导PIVEC 后IL-18 蛋白质表达的变化

黄芩苷对GPS 诱导PIVEC 后IL-18 蛋白质表达的变化如图8 所示。结果表明，模型组与对照组相比，在GPS 诱导下，猪血管内皮细胞中IL-18 蛋白质的表达量极显著上调（P＜0.01），说明GPS 诱导炎性因子大量释放，引起炎症反应；各药物组与模型组相比，GPS+100 μg/mL 黄芩苷处理及BBG 抑制剂处理能极显著下调IL-18 蛋白质的表达量（P＜0.01），GPS+25 μg/mL 黄芩苷、GPS+50 μg/mL 黄芩苷处理能显著下调IL-18 蛋白质的表达量（P＜0.05）。说明黄芩苷与BBG 可以抑制炎性因子释放，从而抑制炎症，表明了P2X7 靶点的关键作用。

图8 黄芩苷对GPS诱导PIVEC 后IL-18蛋白质表达的变化

3 讨论

黄芩苷是从黄芩根中提取分离的黄酮类化合物，原产于中国、韩国、蒙古以及俄罗斯等地，具有很强的生物活性，具有抗菌、抗病毒、抗炎和抗氧化等药理功能，已成为研究热点。Panx-1 作为大孔膜通道，对ATP 和其他信号分子具有高度渗透作用［8］，其重要作用已在多项研究中被证明。2021 年新型冠状病毒感染在全球范围内迅速传播，导致的大流行给世界人民带来严重伤害。Luu 等［9］通过纯化SARS-CoV-2 关键刺突蛋白质诱导人肺上皮细胞，证明Panx-1 通道是SARS-CoV-2 感染的关键因素，应被重视为治疗的潜在靶点。选择黄芩苷为天然药物研究对象，进一步探明干预Panx-1、P2X7 信号通路对控制GPS 在血管内皮细胞损伤的重要性，明确黄芩苷在该通路的调控作用，为进一步动物试验提供可能。