微生物菌剂的茶园抑草效果及对茶叶品质的影响

林占军, 汤江武, 陈小龙, 李达, 李清声*

(1.葳龙生物科技 (浙江) 有限公司, 浙江 杭州 310021; 2.浙江省农业科学院, 浙江 杭州 310021;3.浙江农艺师学院, 浙江 杭州 310021)

除草剂是指可使杂草彻底地或选择性地发生枯死的药剂, 可分为选择性除草剂与非选择性除草剂。目前, 除草剂已成为农业生产过程中至关重要的物料。据统计, 2020 年全球除草剂市场份额占农药总市场的44.2%, 超过杀菌剂 (27.1%) 和杀虫剂 (25.3%)。但随着农业安全生产要求和公众健康意识的提高, 长期使用化学除草剂既有污染环境的风险, 也存在食品安全隐患[1-2]。研制广谱、高效、低毒的生物除草剂既有重要性与必要性, 且迫在眉睫。

生物除草剂是指自然界中可用于除草的生物(包括微生物、植物和动物) 或其组织、代谢物的生物制剂[3-4]。自然界中的植物致病微生物 (真菌、细菌、病毒) 是开发生物除草剂的重要来源[5]。微生物发酵所得的活性产物包括病毒毒素、细菌毒素和真菌毒素等, 相关毒素具有特定或广谱的抑草能力[6]。本研究前期发现, 枯草芽孢杆菌、胶冻样类芽孢杆菌等系列微生物菌剂与发酵所得的代谢产物具有抑草能力, 现将发酵所得微生物菌剂施用于茶园以评价除草效果与对茶树生理形态、生化指标、感官品质的影响。通过该研究希望能够为生物除草剂研发提供思路, 并为茶叶领域应用做好基础工作。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验所用微生物菌剂为枯草芽孢杆菌、胶冻样类芽孢杆菌等系列微生物发酵所得。试剂包括没食子酸、咖啡碱、儿茶素单体 (8 种)、氨基酸 (20种) 等, 均购于Sigma 公司; 乙腈、甲醇、乙酸为色谱纯, 购于Aladdin 公司。

1.2 试验方法

1.2.1 试验条件与周期

本研究抑草效果试验布置于浙江省农业科学院试验基地 (120.21°E, 30.31°N), 茶叶生理生化与品质评价试验布置于杭州茗竹生态农业有限公司茶叶基地 (119.87°E, 30.40°N)。将微生物菌剂稀释为3 个组别, 分别是75 倍 (75 组)、150 倍(150 组)、300 倍 (300 组)。

抑草效果试验: 菌剂稀释液喷施于幼龄茶行间杂草植株上或土层表面, 每667 m2稀释液施用量为40 L, 菌剂施用时间为2022 年6 月25 日, 试验周期为7 d; 抑草效果与草铵膦对比, 草铵膦根据使用说明喷施相当的施用量。

茶叶生理指标与感官审评: 菌剂稀释液喷施于成龄茶行间杂草植株或土层表面, 每667 m2稀释液施用量为40 L, 菌剂施用时间为2022 年6 月25日, 茶样取样时间为2022 年9 月25 日; 对照组(CK) 为同区域未施用微生物菌剂的茶树。

1.2.2 茶树抑草效果鉴定

草铵膦与微生物菌剂喷施后, 分别于0、3、7 d 拍照取证, 观察茶园杂草的枯萎和死亡状况,并作对比。

1.2.3 茶树生理指标

在茶树鲜叶采摘前, 每个处理小区随机取3 个点, 调查每个点 (33.3 cm×33.3 cm) 10 cm 叶层范围内萌动芽以上的芽梢数。在茶园随机取100 个一芽一叶, 称重, 重复3 次, 取平均数记为百芽重。

1.2.4 茶样制备

以绿茶固定样制备法处理茶样。所取茶树新梢摊放4 h, 微波杀青1.5 min, 80 ℃烘干4 h (回潮2 次)。4 ℃冰箱储存用于后续研究。

1.2.5 茶汤提取

称0.150 0 g 干茶 (研磨至粉末), 加入25 mL的50%乙醇, 70 ℃浸提20 min, 隔5 min 摇一次。摇匀溶液转入10 mL 离心管内, 5 000 r·min-1室温离心10 min, 取上清液至新的10 mL 离心管,4 ℃储存备用。

1.2.6 茶多酚总量测定

酒石酸亚铁溶液配制: 称取1 g (准确至0.000 1 g) 硫酸亚铁, 5 g 酒石酸钾钠 (准确至0.000 1 g), 用水溶解并定容至1 L (低温保存,有效期10 d)。

pH 值7.5 磷酸缓冲溶液配制: 称取23.9 g 十二水磷酸氢二钠, 加水溶解后定容至1 L 为1/15 mol·L-1磷酸氢二钠溶液。称取经110 ℃烘干2 h的磷酸二氢钾9.08 g, 加水溶解后定容至1 L 为1/15 mol·L-1磷酸二氢钾溶液。取上述磷酸氢二钠溶液85 mL 和磷酸二氢钾15 mL 混合均匀。

准确取茶汤1 mL, 注入25 mL 的容量瓶中,加4 mL 水和5 mL 酒石酸亚铁溶液, 充分混合, 再加pH 值7.5 的磷酸盐缓冲液至刻度, 在波长540 nm 处, 以空白溶液作对照, 测定吸光度, 根据标准曲线进行计算。

1.2.7 游离氨基酸总量测定

取1/15 mol·L-1的磷酸氢二钠溶液95 mL 和1/15 mol·L-1磷酸二氢钾溶液5 mL, 混匀为pH值8.0 的磷酸盐缓冲液。

称取水合茚三酮 (纯度不低于99%) 2 g, 加50 mL 水和80 mg 二水氯化亚锡搅拌均匀。分次加少量水溶解, 放在暗处, 静置24 h, 过滤后加水定容至100 mL 为2%茚三酮溶液。

称取100 mg 茶氨酸或谷氨酸 (纯度不低于99%) 溶于100 mL 水中, 作为母液, 准确吸取5 mL 母液, 加水定容至50 mL 作为工作液 (1 mL含茶氨酸或谷氨酸0.1 mg)。

分别吸取0、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL 氨基酸工作液于一组25 mL 容量瓶中, 各加水4 mL、pH 值8.0 磷酸盐缓冲液0.5 mL 和2% 茚三酮0.5 mL, 在沸水浴中加热15 min, 冷却后加水定容至25 mL。放置10 min 后, 在570 nm 处, 以试剂空白溶液作对照, 测定吸光度, 制作氨基酸标准曲线。

准确吸取茶汤1 mL, 注入25 mL 的容量瓶中,加0.5 mL pH 值8.0 的磷酸盐缓冲液和0.5 mL 2%茚三酮溶液, 按上述步骤测定氨基酸含量。

1.2.8 儿茶素类及咖啡碱测定

使用HPLC (日本岛津LC-20AD) 检测儿茶素与生物碱组分。分析条件如下: 10 μL 进样量, 流速1 mL·min-1, 安捷伦TC 4.6 mm×250 mm C18色谱柱, 35 ℃柱温, 紫外检测波长为280 nm; 流动相A 配比为乙腈∶乙酸∶水=3.0 ∶0.5 ∶96.5,流动相B 配比为乙腈∶乙酸∶水= 30.0 ∶0.5 ∶69.5; 梯度洗脱条件为35 min 内流动相B 从20%线性增加至65%。参照儿茶素及咖啡碱标准品的色谱行为, 对样品中目标物质进行定性定量。

1.2.9 感官审评

采集各组别茶样, 邀请国家评茶员参照GB/T 23776—2018 进行感官审评。取3.0 g 茶样, 用150 mL 沸水冲泡5 min 后, 按外形 (25%)、汤色(10%)、香 气 (25%)、滋 味 (30%) 及 叶 底(10%) 统计打分。

1.2.10 数据统计

各处理设置3 个重复, 使用SPSS 18 进行方差分析, 差异性用最小显著差异法 (LSD) 分析,P<0.05 为显著差异。

2 结果与分析

2.1 茶树生理指标

2.1.1 抑草效果

试验杂草对象为狼尾草, 稀释75 倍 (75 组)与稀释150 倍 (150 组) 的微生物菌剂均具有抑草效果, 且抑草效果与草铵膦相当; 稀释300 倍(300 组) 的微生物菌剂的抑草效果弱于草铵膦。微生物菌剂喷施之后, 茎与叶片自3 d 起, 逐步发黄、枯萎; 7 d 时狼尾草地上部分死亡。幼龄茶苗未出现生理衰退现象, 茎干和叶片均正常生长, 且与对照组无差异 (图1)。

图1 微生物菌剂 (150 倍稀释) 的抑草效果

2.1.2 发芽密度

成龄茶园以每个点 (33.3 cm × 33.3 cm)10 cm 叶层范围内萌动芽以上的芽梢数为统计对象, 每组3 个点位。对照组茶树发芽22.9 个, 75组茶树发芽15.6 个, 150 组茶树发芽24.6 个,300 组茶树发芽25.5 个。75 组的发芽数为对照组的68.1%, 150 组和300 组的发芽数与对照组差异不显著 (图2)。

图2 微生物菌剂对茶树发芽的影响

2.1.3 百芽重 (一芽一叶)在茶园随机取100 个一芽一叶, 称重, 重复3次。对照组百芽重为22.33 g, 75 组百芽重为18.33 g, 150 组百芽重为20.67 g, 300 组百芽重为23.33 g。75 组的百芽重为对照组的82.1%, 150 组和300组的百芽重与对照组无显著差异(图3)。

图3 微生物菌剂对茶树百芽重的影响

2.2 茶叶生化检测结果

2.2.1 茶多酚和氨基酸含量

对照组、75 组、150 组、300 组茶多酚含量分别为24.07%、21.91%、23.75%、24.44%; 对照组、75 组、150 组、300 组 氨 基 酸 含 量 分 别 为2.82%、3.16%、2.92%、2.78%。75 组的酚氨比最低 (表1)。

表1 茶多酚和氨基酸含量检测结果

2.2.2 儿茶素类和咖啡碱含量

各组别儿茶素类和咖啡碱含量如表2, 其中75组表没食子儿茶素、表儿茶素、表没食子儿茶素没食子酸酯、没食子儿茶素没食子酸酯、表儿茶素没食子酸酯含量最低, 300 组咖啡碱含量最低。300组的儿茶素类与咖啡碱含量与对照组最接近, 75组的儿茶素类与对照组差异最明显。

表2 儿茶素类和咖啡碱HPLC 含量 单位:%

2.3 茶叶审评

对各组别所制茶样进行感官品质评价。其中,75 组的各项指标与总分均最高, 300 组的总分最低; 但对照组、150 组、300 组的总分差异不明显(表3)。

表3 茶叶感官评价结果

3 结论

本试验以微生物菌剂为试验对象, 研究其对茶园杂草的抑草效果、茶树生理状态、生化指标和感官品质的影响。结果表明, 稀释75 倍的微生物菌剂处理茶园, 使茶树发芽密度降低31.9%、百芽重降低17.9%, 但具有降低茶多酚、提高氨基酸的作用, 且感官品质有所提高; 稀释150 倍与稀释300 倍的微生物菌剂处理茶园对茶树发芽密度与百芽重影响总体不显著, 且对茶叶茶多酚、氨基酸、感官品质影响总体不显著。本研究初步探明以枯草芽孢杆菌、胶冻样类芽孢杆菌等系列微生物发酵所得制剂, 具有茶园抑草效果, 且在150 倍或者更低原液浓度的稀释条件下, 对茶树生理生化与感官品质无影响。本研究涉及的技术有望推动微生物菌剂在茶园抑草中的应用。