植物提取物对4 株水稻病原菌的抑菌活性筛选

赵鹏, 杨态娇, 张东华, 张学良, 黄朝政, 伍建榕,2, 刘丽, 闫晓慧*

(1.云南省高校森林灾害预警控制重点实验室 西南林业大学 生物多样性保护学院, 云南 昆明 650224;2.国家林业和草原局西南地区生物多样性保育重点实验室 西南林业大学 林学院, 云南 昆明 650224)

中国约70%的人以稻米为主食, 水稻的种植面积占全国粮食作物种植面积的1/3 左右, 稻米产量约占粮食总产量的一半[1]。稻米品质优劣的影响因素很多, 其中恶苗病、稻瘟病、褐变穗病、稻曲病等真菌病害是影响稻米品质较为关键的病害,不仅造成产量损失, 稻米品质也会因此降低。目前采取的防治措施主要有选育抗病种质资源、化学防治及生物防治。但抗病种质资源面临着抗原不足、抗性丧失等问题, 农药残留、环境污染、抗药性等化学防治问题也频频出现[2]。水稻的产量及品质关乎我国民生、民计及国家战略, 而且随着时代的进步与发展, 人们对于稻米的要求也越来越高。因此, 寻求新型环保的生物农药, 生产绿色健康的稻米, 是目前亟需解决的问题[3], 为保证稻米质量的安全, 紧跟生产绿色产品和发展有机农业的现代农业发展趋势, 保护生态环境安全, 应该重视植物源农药在水稻病害防控中起到的关键作用。

目前常见的有除虫菊、鱼藤、鱼尼丁、苦木、沙巴草、毛叶藜芦和印楝等被应用于植物源农药[4]。近年来, 组合化学技术、生物技术和高通量筛选技术的发展更是极大地推动了植物源农药的发展进程[5-6], 对于植物源农药的研发也成为研究人员探索的重点, 研究发现, 夹竹桃 (Nerium indicum) 提取物对黄瓜褐斑病病原菌 (Corynespora cassiicola) 和番茄叶霉病病原菌 (Cladosporium fulvun) 菌丝生长抑制率超过 70%; 花椒(Zanthoxylumbungeanum) 提取物对番茄叶霉病病原菌 (Cladosporiumfulvun) 和小麦纹枯病病原菌(Rizoctoniacerealis) 菌丝生长抑制率超过60%[7];浓度为20 g·L-1的丁香 (Syzygiumaromaticum)提取物可以完全抑制山核桃干腐病病原菌(Botryosphaeriadothidea) 和油茶炭疽病病原菌(Colletotrichumgloeosporioides); 牡 丹 (Paeonia suffruticosa) 提取物对山核桃干腐病病原菌的抑制率为93.81%, 对油茶炭疽病病原菌的抑制率为100%[8]。

植物源农药开发的核心就是找到更多有抑菌活性的成分, 本文对引起水稻恶苗病、稻瘟病、水稻褐变穗病和稻曲病的病原菌进行分离鉴定, 并测定了17 种植物的23 种提取物对4 种水稻病菌的抑制作用, 筛选出茵陈蒿提取物对水稻恶苗菌、稻瘟菌和水稻褐变穗菌有较好抑制效果, 鱼眼草提取物对水稻稻曲菌有较好抑制效果, 为今后水稻病害的生物防治提供新的思路, 为开发新型植物源杀菌剂提供了科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 植物材料

材料共17 种 (表1), 分别采自云南、辽宁和广西, 由西南林业大学林学院胡世俊副教授鉴定,标本存放于云南省森林灾害预警与控制重点实验室。

表1 供试植物情况

1.1.2 供试菌株

供试菌株有木贼镰孢 (Fusariumequiseti)、稻梨孢 (Pyriculariaoryzae)、极细链格孢 (Alternaria tenuissima)、稻绿核菌 (Ustilaginoideaoryzae)。

1.2 试验方法

1.2.1 植物提取物的制备

将植物材料风干粉碎, 乙醇回流提取3 次, 用旋转蒸发仪浓缩得到提取物, 对于量大的提取物进一步采用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取获得不同溶剂萃取物, 精确称量各提取物用二甲基亚砜(DMSO) 配成100 mg·mL-1的母液, 4 ℃冷藏备用。

1.2.2 病原菌的分离鉴定

病害标本采自石林田间自然发病的水稻植株,对症状典型的病害标本进行田间采集, 并在室内进行显微切片观察初步确定病害种类。采用组织分离对病原菌进行分离、纯化获得病原菌, 接种在马铃薯葡萄糖琼脂培养基 (PDA) 上待病原菌产孢后, 取菌落于载玻片上, 显微观察其形态特征并拍照记录, 通过与文献比对, 并结合分子鉴定技术确定病原菌种类。

1.2.3 菌丝生长抑制活性测定

采用带毒平板法[10]测定。PDA 培养基高压灭菌, 冷却至50 ℃以下, 在培养基中加入巴氏消毒的提取物母液混合均匀, 使终浓度为2 mg·mL-1,以PDA 培养基混合相同浓度的DMSO 溶剂作为对照。在培养的菌落边缘用打孔器打取直径为5 mm的生长整齐一致的菌饼接种于平板中央, 每组处理3 个重复。置于28 ℃恒温培养箱中培养, 直到对照组的菌落长满培养皿, 采用十字交叉法测量各处理组的菌落直径, 计算抑菌率, 并使用SPSS 19.0进行差异显著性分析。

1.2.4 孢子萌发实验

参考康卓等[9]选取培养的已产孢菌种平板,在培养皿中滴加适量无菌水, 用三角刮棒轻轻刮下菌丝表面孢子, 用3 层无菌纱布过滤菌丝, 得到孢子悬浮液。通过血球计数将孢子悬浮液浓度调到每个视野100 个左右孢子备用。在加有供试提取物的溶液中加入孢子悬浮液使提取物终浓度为2 mg·mL-1, 以含相同浓度DMSO 的孢子悬浮液作为对照, 将孢子悬浮液滴在载玻片上, 保湿培养, 15 h后显微镜下检查萌发孢子数量, 计算孢子萌发率、萌发抑制率。

2 结果与分析

2.1 水稻病原真菌的分离鉴定

采用组织分离法对采集自石林田间的水稻恶苗病、褐变穗病、穗颈瘟病及稻曲病的植株标本进行了病原菌分离鉴定 (图1), 显微形态观察发现,水稻恶苗病的病原菌大型分生孢子多孢, 形状呈镰刀形, 小型分生孢子单孢为椭圆至卵圆形, 分生孢子内壁芽式, 确定为木贼镰孢 (Fusarium equiseti)[11], 经ITS 测序、BLAST 比对进一步确认了菌种鉴定结果。水稻褐变穗病的病原菌分生孢子的梗颜色较深, 以合轴式延伸, 顶端产生倒棍棒形、椭圆形或卵圆形的分生孢子, 褐色, 具横、纵或斜隔膜, 顶端无喙或有喙, 单生或串生, 通过与文献比较及分子鉴定结果确定为稻梨孢(Pyriculariaoryzae)[12]。水稻穗颈瘟病菌的分生孢子梗无色, 有横隔膜, 细长, 不分支, 顶端以合轴式产生全壁芽生式分生孢子, 呈屈膝状; 分生孢子为梨形至椭圆形, 确定为极细链格孢 (Alternaria tenuissima)[13-15]。稻曲病菌分生子座形成于寄主子房内, 上密生分生孢子, 分生孢子梗细小, 分生孢子单生, 单胞, 表面有疣状突起, 橄榄绿色, 确定为稻绿核菌 (Ustilaginoideaoryzae)[16]。

图1 水稻病原真菌的分离鉴定

2.2 菌丝生长抑制活性

以15 种植物的18 种提取物为供试药剂, 采用菌丝生长速率法对水稻恶苗病菌进行室内抑菌活性测定 (表2)。抑菌效果最高的是茵陈蒿提取物,抑制率为71.66%, 显著高于其他提取物; 其次为牛尾蒿提取物, 抑菌率为63.33%; 此外, 鱼眼草和全叶马兰提取物的抑菌活性也相对较高, 抑菌率分别为50.00%和41.25% (图2); 其余的14 种植物提取物抑菌率均小于40.00%。

图2 茵陈蒿、牛尾蒿、鱼眼草提取物对木贼镰孢的抑菌效果

表2 植物提取物对木贼镰孢的抑菌活性

以14 种提取物为供试药剂, 采用菌丝生长速率法对稻瘟病菌进行室内抑菌实验。分析结果如表3 所示, 最高的为茵陈蒿提取物, 抑制率为33.33%; 其次为香丝草提取物处理, 抑菌率为30.83%; 其余的12 种植物提取物的处理结果均小于30.00% (图3)。

图3 茵陈蒿、香丝草提取物对稻梨孢的抑菌效果

表3 植物提取物对稻梨孢的抑菌活性

2.3 孢子萌发抑制活性

以10 种提取物为供试药剂, 对稻曲病菌的孢子进行孢子萌发实验。如图4 所示, 抑制孢子萌发效果最好的是鱼眼草提取物, 抑制率为49.68%,其次为墨西哥鼠尾草和茵陈蒿提取物, 抑制率分别为45.38%和43.23%, 其余7 种提取物的抑制率均小于40.00%。

图4 植物提取物对稻绿核菌的抑菌结果

以7 种植物的8 种提取物为供试药剂, 对水稻褐变穗病菌的孢子进行孢子萌发实验。如图5 所示, 其中抑制率最高的为茵陈蒿提取物, 抑制率为73.69%, 其次为牛尾蒿提取物, 抑制率为50.60%, 第 3 为香丝草提取物, 抑制率为45.02%, 其余的5 种提取物的抑制率均小于40.00%。实验发现, 鬼针草地下部分提取物对水稻褐变穗病菌菌丝的生长和孢子的萌发起到了促进的作用。

图5 植物提取物对极细链格孢的抑菌结果

进一步对茵陈蒿提取物进行不同浓度梯度的抑菌活性研究, 浓度分别为: 1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mg·mL-1。结果如表4 所示, 在1.0～3.0 mg·mL-1的浓度范围内, 随着提取物浓度升高, 处理组孢子萌发率从24.25%逐渐降至6.87%, 抑制率从47.01%逐渐升高至84.10%, 抑制率具有一定的线性关系, 线性方程为:y= 3.67x- 0.25,EC50=1.164 mg·mL-1,R2=0.960。

表4 不同浓度茵陈蒿提取物对极细链格孢的抑制活性

3 结论与讨论

农药残留、环境污染、食品安全、病虫害抗药性等都是大量使用化学农药带来的问题, 从植物中开发替代化学农药的高效低毒且环境友好的新型农药一直是植物保护研究的热点领域[17]。Wang研究表明, 千层金 (Melaleucabracteata) 提取物对稻瘟病菌的EC50为33.78 μg·mL-1。金素心等[19]研究发现, 泽漆和薄荷的植物提取物可以明显抑制稻曲病菌。李丽娜等[20]的研究结果表明,0.1 g·mL-1的苦参根提取物对水稻稻瘟菌的孢子萌发抑制率达到100%; 独角莲提取物对番茄叶霉病菌的孢子萌发抑制率为99.50%。江茂生等[21]发现, 浓度为50 mg·mL-1的艾蒿乙醇提取物对水稻纹枯病菌的抑制率大于90%, 对稻瘟病菌的孢子萌发抑制率大于90%, 表明艾蒿具有很大潜力开发为新型植物源农药。闫燕林[22]选用不同溶剂采取索式提取法获得了16 种中草药植物的粗提物,在供试质量浓度为10 g·L-1时, 对稻瘟病的抑制率都大于50%。骆海玉等[23]的研究结果表明, 黔桂千金藤块根、广西地不容块根、石菖蒲根茎和木防己块根的地下根茎提取物对水稻白叶枯病菌都有较好的抑菌活性。朱奇奇等[24]的抑菌初筛研究表明, 八角多酚对水稻纹枯病菌的抑制率高达98.50%。Persaud 等[25]的研究结果表明, 15%的柠檬草、万寿菊、厚叶百里香和丁香提取物对玉米纹枯病菌 (Rhizoctoniasolani) 菌丝生长的抑制作用较强。梁琪研究发现, 甘草、黄连、肉桂的植物提取物可影响稻瘟菌菌丝的生长, 经处理之后, 稻瘟病菌菌丝的生长明显表现得不正常。由此可见, 这3 种植物提取物抑制稻瘟病菌效果突出,具有开发为稻瘟病菌抑制剂的巨大潜力[27]。这些成果说明, 从植物中寻找高效低毒的绿色农药用于水稻病害的生物防治具有广阔的前景。

综合各类不同的植物提取物对水稻恶苗病菌、纹枯病菌、稻曲病菌、褐变穗病菌的处理结果来看, 茵陈蒿、牛尾蒿2 种提取物对4 种水稻病原菌相对都有较为显著的抑制效果。侯海利[28]采用生长速率法测定了茵陈蒿乙醇提取物对23 种植物病原真菌菌丝生长的抑制作用, 发现其浓度为50 mg·mL-1时对小麦赤霉病菌、棉花立枯病菌、油菜菌核病菌、玉米大斑病菌的抑制率为100%, 对番茄晚疫病菌的抑制中浓度为1.36 mg·mL-1。何彦仪用5 种蒿属植物的乙醇提取物测定对马铃薯晚疫病pn5502 和pn7604 菌株的抑菌活性, 其中1 mg·mL-1牛尾蒿粗提物的抑菌活性最强, 抑菌率分别为89.04%和71.38%。通过本试验可知,茵陈蒿和牛尾蒿2 种菊科蒿属植物对4 株水稻病原菌的抑菌活性相对高于其他植物。这2 种植物在野外常见, 来源广且易于成活, 可以作为新型植物源农药开发的原材料。但本试验未进行深入的浓度梯度实验以及抑菌活性物质分析和抑菌机理的研究,今后可进一步追踪研究, 进而为水稻病原菌的生物防治及植物源杀菌剂的研制提供更多的理论支持。