外源诱导尾叶桉非培养内生细菌的激活*

2023-10-27王亚聪田红雨王照玉史晓梦冉隆贤

林业科学 2023年9期

王亚聪王迪田红雨王照玉史晓梦冉隆贤,2

（1. 河北农业大学林学院保定 071000；2. 河北省林木种质资源与森林保护重点实验室保定 071000）

桉树（Eucalyptusspp.）为桃金娘科（Myrtaceae）桉属（Eucalyptus）、杯果木属（Angophora）和伞房属（Corymbia）植物的统称，具有速生、适应性和抗逆性强、用途广等特点，是我国华南地区营造速生丰产林的主要树种之一。桉树原产于澳大利亚、印度尼西亚及其附近岛屿，其引种栽培范围遍及世界5大洲120多个国家和地区（王楚彪等，2021）。目前，全球桉树人工林种植面积超过2 500万hm2，占世界人工林面积的15%，我国桉树种植总面积546万hm2，居世界第3位（彭杏冰等，2021；任世奇等，2021），年产木材5 000万m3以上，为增加森林资源、缓解我国木材供需矛盾发挥了重要作用（Wanget al.，2019；竹万宽等，2020；陈洁纯等，2021）。

微生物是地球上多样性最丰富的生物类群，99%以上的微生物处于存活但非培养（viable but nonculturable，VBNC）状态，这种状态是非芽孢形成菌抵御不良环境的生存机制，在现有技术条件下难以分离培养（贺纪正等，2013；Pintoet al，2015；张硕等，2018），但在条件适宜时菌体可以复苏，能够恢复其在培养基上生长繁殖的能力（Ayrapetyanet al，2018；阚玉敏等，2020）。植物根、茎、叶、花、果实和种子等组织和器官中普遍存在内生细菌，这些内生细菌同其他环境中的微生物一样，因难以模拟其生长繁殖的原位条件大多不能进行纯培养（孙磊等，2006；王跃强等，2006）。田红雨（2020）应用显微镜观察和高通量测序技术在赤桉（E. camaldulensis）、尾叶桉（E. urophylla）和粗皮桉（E. pellita）实生组培苗中均发现大量非培养内生细菌的存在，且优势菌属较相似，分别为假单胞菌属（Pseudomonas）和鞘脂菌属（Sphingobium）细菌。Podolich等（2009）将荧光假单胞杆菌（P. fluorescens）接种马铃薯（Solanum tuberosum）组培苗，使非培养内生细菌甲基营养菌（Methylobacteriumsp. ）恢复到可培养状态。还有研究发现，在培育植物组培苗的过程中，随着继代次数增加，也可出现可培养内生细菌。Thomas等（2008）对香蕉（Musa paradisiaca）茎尖培养继代后不可培养内生菌逐渐恢复活性变成可培养状态。申红妙等（2010）发现尾叶桉组培苗中有存活但不可培养的内生细菌，但组培苗继代培养至第8代后能够分离到可培养内生细菌。宋艳祥等（2011）利用枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）CN030菌株与桉树组培苗共培养，分离出至少6种优势的非培养内生细菌。

桉树青枯病在广东、广西和海南等省（区）发生严重，重病区植株死亡率高达98%，一般流行区死亡率也达30%～50%（张民兴等，1996），给桉树生产造成极大威胁，成为桉树行业亟待解决的问题（Zhouet al.，2011）。Ran等（2005a）研究发现，应用菌液蘸根法荧光假单胞杆菌 WCS417r对桉树青枯病具有显著防治效果，恶臭假单胞杆菌（P. putida）WCS358r对桉树青枯病具有较好防治作用，但其嗜铁素缺失突变体完全失去防治效果，而荧光假单胞杆菌WCS374r没有防治作用；Ran等（2005b）对这些菌株进行诱导抗病性研究得出，WCS358r和WCS374r能够诱导桉树抵御青枯病，WCS358r产生的嗜铁素缺失突变体没有诱导效果，说明嗜铁素是WCS358r菌株诱导桉树抗青枯病的关键因子，而WCS374r的嗜铁素缺失突变体仍具有诱导抗病活性。鉴于此，本研究在利用上述3种细菌对桉树青枯病进行生物防治和诱导抗病性研究的基础上，进一步探究这些细菌对桉树非培养内生细菌的激活作用，以期为应用内生细菌防治桉树青枯病提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 桉树种子尾叶桉种子，广东省雷州林业局提供，用于培养无菌实生苗。

1.1.2 培养基与试剂尾叶桉无菌实生苗培养选用1/2 MS培养基；细菌培养选用KB培养基。

1.1.3 供试菌株外源菌株恶臭假单胞杆菌WCS358r和荧光假单胞杆菌WCS374r及其嗜铁素缺失突变体JM218和Mut2，荧光假单胞杆菌WCS417r及其脂多糖缺失突变体WCS417OA-(B4)，均由荷兰乌特勒支大学提供。

1.2 尾叶桉无菌实生苗的培养

挑选健康饱满的尾叶桉种子，在超净工作台上依次用75%乙醇消毒30 s、0.1% HgCl2消毒2 min后，用无菌水冲洗3～4次，播种到1/2 MS培养基上，置于25 ℃光暗交替的环境中培养，成苗后对桉树苗进行继代培养，获得多株同源同代尾叶桉实生苗。

1.3 菌悬液与细菌代谢液的制备

外源菌WCS358r、WCS374r和WCS417r在KB培养基上纯化培养1～2天后，用无菌水将WCS358r配制成103、105、107、108和109CFU·mL-1的菌悬液，将WCS374r、WCS417r配制成108CFU·mL-1的菌悬液，备用。同样方法将上述3种外源菌的突变体JM218、Mut2和WCS417OA-(B4)用无菌水分别配制成108CFU·mL-1的菌悬液，备用。

1.4 桉树非培养内生细菌的激活

1.4.1 3种外源菌及其突变体与同源同代桉树实生苗共培养选取长势基本相同的同源同代桉树实生苗21株。取筛过的河沙12 g于西林瓶中，再将西林瓶置于300 mL组培瓶内，间隔24 h进行2次高温高压灭菌，每次灭菌时间1 h。在无菌条件下将桉树实生苗移栽至装有无菌河沙的西林瓶内，每瓶1株，处理组分别浇淋4 mL浓度108CFU·mL-1的外源菌或其突变体的菌悬液，对照组浇淋等量无菌水。最后，在组培瓶中加入适量无菌水用于保湿，置于12 h光暗交替的25 ℃环境中培养。

1.4.2 WCS358r与尾叶桉种子实生苗共培养采用上述同样方法对过筛河沙进行称重、装瓶和灭菌处理，备用。选取由尾叶桉种子无菌萌发的实生苗4株，编号。无菌条件下将桉树苗分别移栽至装有无菌河沙的西林瓶内，每瓶1株，并依照苗号做好标记，分别浇淋4 mL浓度108CFU·mL-1的WCS358r菌悬液，对照组浇淋等量无菌水。同样向组培瓶中加入适量无菌水并封口后，置于25 ℃、12 h光暗交替环境中培养。

1.4.3 不同浓度WCS358r与同源同代桉树苗共培养选取长势基本相同的同源同代尾叶桉实生苗15株。称取12 g过筛河沙，按照上述同样方法进行装瓶和灭菌，备用。在无菌条件下将选取的桉树实生苗分别移栽至装有无菌河沙的西林瓶内，每处理3株，分别浇淋4 mL浓度103、105、107和109CFU·mL-1的WCS358r菌悬液，对照组浇淋等量无菌水。组培瓶中加入适量无菌水并封口后，置于25 ℃、12 h光暗交替环境中培养。

1.5 桉树非培养内生细菌的分离与纯化

1.5.1 非培养内生细菌的分离外源菌与桉树苗共培养21 天后，在无菌条件下用无菌水将桉树苗根部河沙冲洗干净，并将其分成根、茎、叶3部分，分别称量并记录。根、茎、叶分别采用上述方法进行表面消毒，取最后1次冲洗液200 µL涂平板，检测消毒效果。各部位的桉树苗材料分别在3个无菌研钵内加入1 mL无菌水研磨成浆，稀释100倍后，取研磨液200 µL涂平板，置于28 ℃培养箱内培养。对照组桉树苗也按同样处理方式，分离非培养内生细菌。

1.5.2 非培养内生细菌的纯化研磨液培养3～7 天后，先依据长出细菌的表面颜色和形态特征进行初步分类并编号，再将编号后的细菌转接至新的KB培养基内，28 ℃下纯化培养。为避免丢失一些生长较慢的内生细菌，初始分离的培养皿放回培养箱内继续培养、观察。

1.6 激活内生细菌的鉴定

1.6.1 抗利福平检测所接种的外源菌及其突变体均为经过抗利福平筛选的细菌，能够在含150 µg·mL-1利福平的培养基上正常生长，因此通过抗利福平试验，可依据细菌生长情况判定从桉树植株中分离出来的细菌是否为接种后定殖的外源菌。无菌条件下，在融化的KB培养基中加入无菌利福平母液，摇匀，使利福平在培养基中的浓度为150 µg·mL-1，倒入培养皿内，待其冷却凝固后，用灭菌牙签按顺序点接标记好的内生细菌菌落于培养基上，并对应标号，置于28 ℃下培养，24 h后观察点接菌落的生长情况，并以未加利福平的KB培养基作为对照。

1.6.2 革兰氏染色反应在超净工作台内，用灭菌吸管滴1～2滴3%KOH溶液于干净的载玻片上，再用接种环挑取待测细菌单菌落到KOH溶液中并顺时针搅拌。如果搅拌液稀薄呈粥样，不能拉丝则该细菌为革兰氏阳性菌；如果搅拌液黏稠，拉出细丝则为革兰氏阴性菌（Suslowet al.，1982）。

1.7 被激活内生细菌的分子鉴定

1.7.1 细菌总DNA提取将纯化的内生细菌再重新培养1～2 天，培养条件同上。参照DNA提取试剂盒说明书分别提取各菌体DNA，取上清液作为DNA模板，备用。

1.7.2 PCR扩增反应参照PCR扩增细菌16S rDNA试剂盒说明书，采用50 µL 扩增体系，对目的片段进行PCR扩增，利用1.2%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。获得目的条带后，对DNA琼脂糖进行切胶纯化。

1.7.3 DNA测序切胶回收目的片段，以SEQForward、SEQInternal和SEQReverse为引物进行DNA测序。将所测基因序列在NCBI上与已知序列进行BLAST比对，选取相似度较高的序列，使用Mega5.0构建系统发育树，确定外源菌激活获得的非培养内生细菌的分类地位。

1.8 数据分析

利用Excel 2016软件整理试验数据，采用SPSS 22.0软件的单因素方差分析统计各处理平均值的差异，并用Duncan多重比较对所得数据进行差异显著性检验，计算并绘制图表。

2 结果与分析

2.1 不同外源菌及其突变体对桉树苗内生细菌的激活

3种外源菌及其突变体对同源同代桉树苗进行激活处理后，从WCS358r处理的桉树苗中共分离纯化出3种内生细菌，经抗利福平试验发现其中1种优势菌株为接种后定殖在桉树体内的外源菌WCS358r，其主要定殖在桉树苗根部，平均定殖量达6.76×106CFU·g-1（表1），另外2种内生细菌为被激活的非培养内生细菌，经染色鉴定均为革兰氏阳性菌株，分别编号5和6（表2）；从WCS417r处理的桉树苗中只分离出1种内生细菌，经抗利福平试验鉴定为接种后定殖在桉树体内的外源菌WCS417r，其在桉树根和茎部的定殖量显著高于叶部（P＜0.05）（图1）；而接种外源菌WCS374r及其突变体Mut2、WCS358r的嗜铁素缺少突变体菌株JM218和WCS417r的脂多糖缺失突变体菌株WCS417OA-(B4)后，桉树苗中均未发现接种的外源菌，且也未分离出其他细菌，与对照组的桉树苗相同。

图1 WCS417r在桉树各部位的定殖情况Fig. 1 The colonization of WCS417r in E. urophylla

表1 WCS358r在桉树体内的定殖情况（对数值）Tab. 1 The colonization of WCS358r in E. urophylla(lg CFU·g-1, fresh weight)

表2 WCS358r激活桉树内生细菌情况（对数值）①Tab. 2 Resuscitation of uncultured endophytic bacteria by WCS358r in E. urophylla (lg CFU·g-1, fresh weight)

2.2 外源菌WCS358r对尾叶桉不同种子实生苗内生细菌的激活

外源菌WCS358r能成功定殖在桉树实生苗根、茎部位，定殖量表现为根＞茎（表3），而其激活的桉树非培养内生细菌主要分布在茎部和叶部，其中苗1中分离出2种桉树非培养内生细菌，编号为1和2；苗2中分离出2种桉树非培养内生细菌，编号3和4；苗4中分离出1种桉树非培养内生细菌，编号为8（表4）。经染色鉴定以上激活出的非培养内生细菌，均为革兰氏阳性菌株。其他处理后的桉树苗与对照组桉树苗均未分离到内生细菌。

表3 WCS358r在不同桉树实生苗内的定殖情况（对数值）Tab. 3 The colonization of WCS358r in different E. urophylla seedlings (lg CFU·g-1, fresh weight)

表4 WCS358r激活不同桉树实生苗内生细菌情况（对数值）①Tab. 4 Resuscitation of uncultured endophytic bacteria by WCS358r in different E. urophylla seedlings(lg CFU·g-1, fresh weight)

2.3 不同浓度WCS358r对桉树非培养内生细菌的激活

由表5可知，浓度105和107CFU·mL-1的WCS358r处理同源同代桉树苗后，只在桉树苗根部分离出1种细菌，经抗利福平试验鉴定为外源菌WCS358r；浓度为109CFU·mL-1时，从桉树苗中分离出3种细菌，其中1种细菌经鉴定为外源菌WCS358r，另外2种细菌为非培养内生细菌，编号为5和7（表6），为革兰氏阳性菌；外源菌浓度为103CFU·mL-1时与对照组均未分离得到内生细菌。

表5 不同浓度WCS358r在桉树苗内定殖情况（对数值）Tab. 5 The colonization of different suspension of WCS358r in E. urophylla (lg CFU·g-1, fresh weight)

表6 WCS358r浓度为109 CFU·mL-1对桉树内生细菌的激活情况（对数值）①Tab. 6 Resuscitation of uncultured endophytic bacteria in E.urophylla by WCS358r at a population density of 109 CFU·mL-1(lg CFU·g-1, fresh weight)

2.4 被激活内生细菌的初步鉴定

2.4.1 抗利福平检测从处理后的桉树体内分离到接种的外源菌株WCS417r和WCS358r，其均可在含150 µL·mL-1利福平的KB培养基上正常生长。从植株中分离出的其余8种细菌对利福平没有抗性，且颜色和形态与接种的外源菌也有明显差异，可判断为激活的非培养内生细菌，其在不含利福平的KB培养基上的培养状态和生长特征如表7和图2所示。

图2 被激活内生细菌的菌落形态Fig. 2 The colony morphology of resuscitated endophytic bacteria in E. urophylla1—8号代表被激活的内生细菌菌株。No.1-8 indicate resuscitated endophytic bacterial strains.

表7 尾叶桉中被激活内生细菌的主要特征Tab. 7 The main characteristics of endophytic bacteria of E. urophylla

2.4.2 革兰氏染色反应被激活的1～8号非培养内生细菌，全部为革兰氏阳性细菌。

2.5 被激活内生细菌的分子鉴定

对8种内生细菌分别提取并扩增DNA后，进行16S rDNA菌种鉴定。将测序结果与NCBI菌种数据库进行比对，并用Mega5.0软件进行分析后构建系统进化树（图3），初步确定被激活细菌的分类地位：1号与链霉菌属5种菌的同源性均达100%；2号与短小芽孢杆菌的同源性达100%；3号与蜡样芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌达100%的同源性；4号与枯草芽孢杆菌、龙舌兰芽孢杆菌和漠海威芽孢杆菌亲缘关系比较近，均达99%的同源性；5、6和8号与解淀粉芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和甲基营养型芽孢杆菌亲缘关系比较近；7号与枯草芽孢杆菌和龙舌兰芽孢杆菌亲缘关系比较近。

图3 被激活内生细菌系统发育学地位Fig. 3 The phylogenetic tree of resuscitated endophytic bacteria1—8号代表被激活的内生细菌菌株。No.1-8 indicate resuscitated endophytic bacterial strains.

3 讨论

3.1 影响桉树非培养内生细菌激活能力的因素

在同源同代桉树苗中接种WCS358r、WCS374r和WCS417r 3种不同外源菌后，其在桉树体内的定殖能力及对植物非培养内生细菌的激活能力均有差异。在桉树根、茎和叶中均检测到大量外源菌株WCS417r，只在根和茎中检测到外源菌株WCS358r，WCS374r未成功定殖于桉树任何部位，外源菌株的定殖能力表现为WCS417r＞WCS358r＞WCS374r。Ran等（2005a）选用这3种菌株以蘸根方式进行桉树青枯病防治试验，WCS417r的防治效果显著，WCS358r具有一定生防效果，而WCS374r没有生防效果，与本试验的定殖情况具有相似特性，推测生防菌对桉树青枯病的防治效果可能与其定殖能力有关。本研究还发现，WCS358r的嗜铁素缺失突变体JM218未能在同源同代桉树苗中激活出非培养内生细菌，失去野生型菌株原有的激活能力，WCS417r的脂多糖缺失突变体菌株WCS417OA-(B4)不能定殖于桉树体内，失去野生型菌株原有的定殖能力，这表明细菌的脂多糖基因会影响细菌的定殖能力，而嗜铁素基因会影响细菌对桉树非培养内生细菌的激活能力。

3.2 可被激活的桉树非培养内生细菌

从桉树实生组培苗中激活出的非培养内生细菌大多数为芽孢杆菌（Bacillus），少数为链霉菌属（Streptomyces）。目前诸多报道证实芽孢杆菌广泛存在于许多植物体内，且占比较高，包含枯草芽孢杆菌（B. subtilis）、蜡样芽孢杆菌（B. cereus）和短小芽孢杆菌（B. pumilus）等多种芽孢杆菌（Rangelet al.，2022；Vendanet al.，2010；葛慈斌等，2015；Goulartet al.，2019；龚国利等，2020），因此，使用外源激活菌从桉树体内激活出非培养内生芽孢杆菌较多可能与其在桉树内的存在数量有关，但仍需进一步验证。芽孢杆菌是目前生产上开发和应用最为成熟的生防菌之一，但除芽孢杆菌外，本研究中还激活出链霉菌，有研究表明链霉菌在植物病害的生物防治上也具有广阔应用前景（Kanget al., 2022；Pereiraet al.,2022）。杨凤环（2008）研究发现，内生链霉菌CN122对桉树青枯病菌具有明显防治效果，但应用内生链霉菌防治桉树青枯病还需进一步探究。

本研究使用外源菌从桉树组培苗中激活出来的非培养内生细菌全部为革兰氏阳性菌，宋艳祥（2011）用枯草芽孢杆菌CN030激活桉树组培苗也出现同样情况。目前对于VBNC态细菌恢复培养能力的机制尚不明确，因此对于本研究中出现的这种现象还无法解释。已知复苏促进因子（resuscitation promoting factor，Rpf）能够促进休眠菌的复苏（Wanget al., 2022），有学者认为Rpf广泛存在于厚壁菌门的革兰氏阳性细菌中，参与肽聚糖合成等过程，有的革兰氏阳性细菌中甚至含有5个Rpf基因，在部分革兰氏阴性菌中也发现类似于Rpf的蛋白质，利于细菌的复苏（张晓华等，2020）。另外，本研究选用的3种外源激活菌均为革兰氏阴性菌，在之后的研究中可以同时对比革兰氏阳性菌和阴性菌的激活试验结果，以深入探究固有内生细菌的激活规律。

目前，对VBNC态的细菌进行恢复培养的研究报道很多（Panutdapornet al.，2006；Suet al.，2015；张艳军等，2020），如有些研究探究吐温对VBNC菌的复苏作用（田聪等，2013；Zenget al.，2013；蒋丽芬，2017），今后的研究也可探索更多不同的复苏刺激因子对桉树非培养内生细菌的激活作用，为挖掘更多的潜在微生物资源和应用桉树内生细菌进行青枯病防治提供参考。