狗枣猕猴桃多酚提取物对小鼠的抗疲劳作用

刘诗宇,王钰涓,张 威,王 巧,左丽丽

(吉林医药学院公共卫生学院,吉林 吉林 132013)

疲劳是由于大脑或体力衰竭而引起的机体一种复杂的生理和生物现象,同时也是当今社会普遍存在的健康问题[1]。随着社会经济的不断发展和人们生活节奏的日益加快,越来越多的人容易出现疲劳的症状。疲劳使体内器官产生生理性变化,不能维持器官的正常工作,会造成机体免疫力下降甚至产生疾病[2-4]。同时,疲劳也会使人精力不集中,造成工作效率下降[5,6],甚至导致衰老、抑郁、癌症和帕金森症等多种疾病[7-9]。目前,药物治疗是延缓疲劳症状的主流选择,但长期用药可能会产生严重的毒副作用[10]。因此,探寻安全、健康、有效的天然抗疲劳活性成分受到越来越多国内外学者的广泛关注。

目前,国内外已有许多关于食物中活性物质的抗疲劳作用研究[11-13]。研究发现,茶多酚可以缓解运动员运动过程中和高强度训练后肌肉的疲劳感[14]。多酚在一定程度上还具有提高机体运动耐力和耐缺氧能力、抗疲劳等多种功效[15,16]。狗枣猕猴桃(Actinidiakolomikta)为猕猴桃科猕猴桃属的落叶藤本植物,是广泛分布于东北地区的野生猕猴桃品种之一,也是东北大兴安岭、长白山地区极具经济价值的小浆果植物[17-19]。前期研究发现,狗枣猕猴桃果实中含有丰富的多酚物质和其他活性成分,具有一定的抗肿瘤、抗辐射和抗衰老等功能[20],而关于狗枣猕猴桃多酚活性成分抗疲劳相关的研究较少。因此,本试验拟研究狗枣猕猴桃多酚提取物(Actinidiakolomiktapolyphenols extract,APE)对小鼠疲劳的缓解作用,为狗枣猕猴桃抗疲劳功能食品的开发提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 主要材料与试剂 狗枣猕猴桃多酚提取物(APE,纯度为48.6%),由吉林医药学院慢病实验中心实验室制备;清洁级雄性ICR小鼠,6～8周龄,体重(22±2)g,生产许可证号:SCXK(吉)2015—0005,购于长春市亿斯实验动物技术有限责任公司;乳酸(Lactic acid,LD,批号20201102)检测试剂盒、肝/肌糖原(Hepatic/muscle glycogen,HG/MG,批号20201026)检测试剂盒、尿素氮(Blood urea nitrogen,BUN,批号20201026)检测试剂盒、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD,批号20201024)检测试剂盒、丙二醛(Malondialdehyde,MDA,批号20201024)检测试剂盒和还原型谷胱甘肽(Glutathione,GSH,批号20201026)试剂盒,均购于南京建成生物工程研究所。

1.2 主要仪器 低速离心机(TDZ4-WS),湖南湘仪实验仪器有限公司产品;旋转蒸发仪(RE-3000),上海亚荣生化仪器厂产品;冻干机(FDU-2110),日本EYELA东京理化器械株式会社产品;酶标仪(HT-2),Biocell公司产品。

1.3 试验方法

1.3.1 狗枣猕猴桃多酚的分离纯化 挑选一定量新鲜狗枣猕猴桃浆果,使用料理机将其粉碎打浆,用60%的乙醇按照1∶3的料液比,45 ℃超声30 min提取其中的多酚类成分,离心收集上清,残渣用同样方法重复提取3次,合并提取液,减压浓缩至一定体积,并通过AB-8大孔树脂进行纯化,收集洗脱液并将其浓缩后冻干,采用福林酚测定其多酚含量,冻干粉保存于-20 ℃冰箱,备用。

1.3.2 小鼠的分组和给药 60只ICR雄性小鼠在温度18～22 ℃、相对湿度40%～70%的条件下适应性饲养1周后用于试验。将小鼠随机分为6个组:空白对照组、疲劳模型组、茶多酚对照组[30 mg/(kg·bw·d)茶多酚]、狗枣猕猴桃多酚低[25 mg/(kg·bw·d)]、中[50 mg/(kg·bw·d)]和高剂量组[100 mg/(kg·bw·d)],每组10只,使用苦味酸将其进行组内和组间标记,药物组每天按时灌胃1次,空白对照组和疲劳模型组每日对小鼠灌胃与药物组等体积的生理盐水,连续灌胃15 d。

1.3.3 小鼠负重游泳试验 试验小鼠连续灌胃给药15 d后,从每组中随机抽取3只小鼠进行负重游泳试验。即在末次给药后30 min,在不影响小鼠游泳的前提下,按照5%小鼠体重计算,将一定质量的锡丝捆绑在小鼠尾部,将其置于游泳缸[水温为(25±1) ℃、深度为30 cm]中进行游泳,记录小鼠自游泳开始至其力竭游泳的时间,保持小鼠头部沉入水中10 s后不能自行游出水面进行呼吸,即为其力竭游泳时间[21]。

1.3.4 小鼠不负重游泳试验和取材 取材前小鼠禁食给水12 h。将小鼠置于水温为(25±1)℃的游泳缸中不负重游泳90 min后,将其捞出擦干,置于室温环境中休息30 min后,摘眼球取血,4 ℃条件下3 000 r/min离心10～15 min,取上清液快速分离血清,做好标记并保存于-80 ℃冰箱备用。颈椎脱臼处死小鼠,快速分离小鼠肝脏和骨骼肌组织,同时使用生理盐水将组织清洗数次,去除血污并清理干净结缔组织,用滤纸吸干组织表面多余的水分,标记后放置于-80 ℃冰箱保存备用。

1.3.5 小鼠体内生化指标的测定 采用试剂盒检测小鼠血清中BUN和LD含量,肝组织中HG、MDA、GSH含量和SOD活力,肌肉组织中MG含量,严格按照试剂盒说明书方法进行检测。

1.4 统计与分析 数据结果以“平均值±标准差”表示,通过SPSS 19.0统计软件进行数据分析,各组间均数比较采用单因素方差分析,同时采用Origin 9.1软件进行做图分析。

2 结果

2.1 APE对小鼠负重游泳时间的影响 如图1所示,与疲劳模型组相比较,狗枣猕猴桃多酚低和中剂量组小鼠的负重游泳时间变化没有统计学意义(P>0.05),而高剂量组和茶多酚对照组小鼠负重游泳时间极显著延长(P<0.01),狗枣猕猴桃多酚高剂量组小鼠负重游泳时间达到(30.31±5.91)min,比疲劳模型组提高了66.49%,与茶多酚对照组小鼠的负重游泳时间[(31.15±5.21)min]相当。即一定剂量的APE能延长小鼠负重游泳时间,并提高小鼠疲劳的耐受性,缓解小鼠疲劳。

图1 狗枣猕猴桃多酚提取物对小鼠负重游泳时间的影响Fig.1 Effects of Actinidia kolomikta polyphenols extract on the exhaustive swimming time of mice与疲劳模型组相比,**P<0.01Compared with Fatigue model group,**:P<0.01

2.2 APE对疲劳小鼠血清BUN含量的影响 如图2所示,与空白对照组相比,疲劳模型组小鼠血清BUN含量上升了12.18%(P<0.05)。干预一段时间后,与疲劳模型组进行比较,狗枣猕猴桃多酚中和高剂量组小鼠血清BUN含量均有所下降(P<0.05或P<0.01),茶多酚对照组、狗枣猕猴桃多酚中和高剂量组小鼠血清BUN含量分别下降了8.53%、11.56%和14.20%,表明体内能源物质供给相对比较充足,能够满足机体需要,从而蛋白质和氨基酸分解代谢减少,即APE干预可显著降低小鼠运动后血清BUN含量。

图2 狗枣猕猴桃多酚提取物对疲劳小鼠血清尿素氮含量的影响Fig.2 Effects of Actinidia kolomikta polyphenols extract on serum BUN content in fatigue mice与空白对照组相比,#:P<0.05,##:P<0.01; 与疲劳模型组相比,*:P<0.05,**:P<0.01; 下同Compared with the Blank control group,#:P<0.05,##:P<0.01; Compared with the Fatigue model group,*:P<0.05,**:P<0.01. The same as below

2.3 APE对疲劳小鼠血清LD含量的影响 运动后会导致机体产生大量乳酸,乳酸大量积累会导致机体产生疲劳。如图3所示,与空白对照组相比,疲劳模型组小鼠血清LD含量极显著上升(P<0.01),达到(11.58±0.77) mmol/L。干预一段时间后,与疲劳模型组相比,给药组血清LD含量均出现不同程度的下降,狗枣猕猴桃多酚提取物低、中、高剂量组和茶多酚对照组小鼠血清LD含量分别降低了8.81%、20.47%、55.22%和30.48%(P<0.05或P<0.01),表明APE可以有效清除机体高强度运动过程中代谢产生的乳酸。

图3 狗枣猕猴桃多酚提取物对疲劳小鼠血清乳酸含量的影响Fig.3 Effects of Actinidia kolomikta polyphenols extract on serum LD content in fatigue mice

2.4 APE对疲劳小鼠HG和MG含量的影响 机体的运动耐力与体内糖原含量的多少存在着直接关系[22]。与空白对照组相比,疲劳模型组小鼠MG含量下降了40.04%(P<0.01),表明运动导致小鼠消耗大量的能源物质,代谢物质不断积累,最终使小鼠产生运动性疲劳。干预一段时间后,与疲劳模型组相比,狗枣猕猴桃多酚低、中、高剂量组和茶多酚对照组小鼠体内MG含量分别提高了34.16%、40.32%、94.78%和117.00%(P<0.01)(图4A),即APE使得小鼠体内MG分解减少,储备增加,节省糖原的利用,从而使得机体运动能力得到有效提高。同时,与空白对照组相比,疲劳模型组小鼠体内HG含量降低了57.5%(P<0.01),HG分解为机体提供一定的能量,随着运动时间进一步延长,HG不断被消耗,其储备量随之减少。与疲劳模型组相比,狗枣猕猴桃多酚提取物低、中、高剂量组和茶多酚对照组疲劳小鼠体内HG含量分别上升了25.46%(P>0.05)、33.26%、54.26%和293.84%(P<0.05或P<0.01)(图4B),表明APE能够增加糖原储备量,减少运动中能源消耗,从而提高运动耐力,改善运动型疲劳。

图4 狗枣猕猴桃多酚提取物对疲劳小鼠肌糖原(A)和肝糖原(B)含量的影响Fig.4 Effects of Actinidia kolomikta polyphenols extract on MG(A) and HG(B) content in fatigue mice

2.5 APE对疲劳小鼠肝脏SOD活力的影响 SOD是一类广泛存在于机体各种组织细胞内的抗氧化金属酶,其作用主要是清除体内多余的超氧阴离子自由基。如图5所示,与空白对照组相比,疲劳模型组小鼠肝脏中SOD活力下降至(206.61±8.62) U/mgprot(P>0.05)。干预一段时间后,与疲劳模型组相比,低、中、高剂量的狗枣猕猴桃多酚提取物使疲劳小鼠肝脏SOD活力分别提高了38.80%、44.41%和87.48%(P<0.01),且呈现一定的剂量依赖关系;茶多酚对照组小鼠肝脏SOD活力也有所提高,但差异不显著(P>0.05),提示APE能够提高疲劳小鼠体内SOD活力,增强机体抗氧化能力,从而进一步发挥其对小鼠的抗疲劳作用。

图5 狗枣猕猴桃多酚提取物对疲劳小鼠肝组织超氧化物歧化酶活力的影响Fig.5 Effects of Actinidia kolomikta polyphenols extract on SOD activity of liver in fatigue mice

2.6 APE对疲劳小鼠肝脏MDA含量的影响 MDA的含量是反映机体抗氧化能力的重要指标之一,其主要反映机体发生脂质过氧化反应的速率,同时也进一步反映细胞膜受到损伤的程度,机体中MDA含量越高,说明细胞受到的损伤越严重。如图6所示,与空白对照组相比,疲劳模型组小鼠肝脏中MDA含量显著升高了30.0%(P<0.01)。干预一段时间后,疲劳小鼠肝脏中MDA含量逐渐下降,尤其是高剂量的狗枣猕猴桃多酚提取物使小鼠体内MDA含量下降了23.24%(P<0.01),达到空白对照组水平,表明一定剂量的APE对疲劳诱发的机体氧化损伤起到一定程度的保护作用。

图6 狗枣猕猴桃多酚提取物对疲劳小鼠肝脏MDA含量的影响Fig.6 Effects of Actinidia kolomikta polyphenols extract on MDA content of liver in fatigue mice

2.7 APE对疲劳小鼠肝脏GSH含量的影响 GSH是体内低分子量的自由基清除剂,具有一定的抗氧化和抗衰老作用。如图7所示,与空白对照组相比,疲劳模型组小鼠肝脏中GSH含量下降了15.33%(P>0.05)。干预一段时间后,茶多酚和低、中、高剂量的狗枣猕猴桃多酚提取物使疲劳小鼠肝脏中GSH含量分别升高了19.29%(P>0.05)、44.88%、53.94%和66.14%(P<0.05或P<0.01),且呈现出一定的剂量依赖关系,即APE能够提高疲劳小鼠体内GSH含量,从而显示出一定的抗疲劳效果。

图7 狗枣猕猴桃多酚提取物对疲劳小鼠肝脏中还原型谷胱甘肽含量的影响Fig.7 Effects of Actinidia kolomikta polyphenols on GSH content of liver in fatigue mice

3 讨论

本试验通过构建疲劳小鼠模型,分析APE的抗疲劳作用。机体运动时,肌肉发生收缩会消耗体内的糖原从而维持血糖水平,并为肌肉活动提供一定的能量,有效延缓疲劳的产生[23]。HG和MG是机体中糖的储能形式,其在机体需要能量时会发生分解产生葡萄糖,其中MG直接为运动提供一定的能量,所以体内MG的含量与机体的运动耐力呈正比关系[24,25]。本试验结果表明,APE能够有效降低运动引起的HG和MG的消耗,使得体内HG和MG等能源物质的含量有一定程度增加,从而大大延缓疲劳的产生,小鼠游泳耐力得到增强,负重游泳力竭时间显著延长,与陈蓉等[26]和Peng等[27]的研究结果一致。

有研究表明,短时间内进行高强度的运动,对氧的需求量大,会导致氧的供应量缺乏,增加糖原代谢,使血清中的代谢产物如LD和BUN等不断增加,进一步引起肌肉收缩效率下降,最终导致体力衰竭[28]。BUN是机体中蛋白质和氨基酸等物质代谢的主要终末产物,是具有代表性的疲劳生化指标[29]。本试验中疲劳模型组小鼠血清BUN含量显著上升,提示糖类和脂肪等物质的分解代谢产生的能量已不能满足机体运动所需,此时需要蛋白质分解代谢为机体补充一定的能量,导致血清BUN含量有所增加,BUN积累导致肌肉收缩力下降并诱发疲劳[30]。同时,随着运动强度的加剧,体内氧气供给不足,肌肉开启无氧方式提供能量,随之使机体产生大量LD,LD堆积到一定程度后会引起神经传导、糖酵解和肌肉收缩等生物过程障碍,致使机体产生疲劳[31]。本试验结果表明,APE可在一定程度上减少机体运动后血清中LD和BUN等代谢产物的含量,使得机体能量代谢得到改善,从而对抗运动性疲劳,而狗枣猕猴桃多酚低剂量组BUN下调效果不理想,可能是由于个体差异导致的。有研究显示,多酚类物质能够提高机体乳酸脱氢酶的活力,并使运动后LD水平降低[32,33],从而有效避免代谢产物堆积对机体产生的伤害,提高机体适应高强度运动的能力和抗疲劳的能力。因此,狗枣猕猴桃多酚和茶多酚均可能是通过调节乳酸脱氢酶的活力从而有效抑制运动后LD的积累和生成,进一步缓解血LD在体内的堆积,从而延缓体力疲劳的程度。

研究显示,剧烈运动可导致机体活性氧产生加速,体内氧自由基和自由基清除系统平衡被打破,导致机体产生氧化应激损伤,降低体内抗氧化物酶的活力[34,35]。本试验结果显示,APE通过提高机体SOD活力并降低MDA含量来抑制运动诱导的氧化应激。

综上所述,APE表现出一定的抗疲劳作用,其作用机制可能是增加能量储备、抑制氧化应激并及时消除疲劳产生的代谢产物。因此,可以进一步从抗氧化、能量代谢和分子生物学等方面开展深入研究,以期为新型抗疲劳功能性食品的开发利用提供一定的科学依据。