新型狂犬病疫苗的研究进展

王运航,王田田,张雅雅,米耀云,黄 艳,李河林,郭慧琛,敬晓棋

(1. 榆林学院生命科学学院,陕西 榆林 719000 ; 2. 中国农业科学院兰州兽医研究所,甘肃 兰州 730046 ; 3. 榆林市榆阳区动物疫病预防控制中心,陕西 榆林 719000)

狂犬病(Rabies)是由狂犬病病毒(Rabies virus,RABV)引起的急性、高度致死性的烈性人兽共患病[1],因其分布广泛、病死率极高,受到了广泛关注。据统计,全球每年有约59 000人因狂犬病导致死亡,其中亚洲和非洲地区为狂犬病的重灾区[2]。因此,暴露前的疫苗接种就显的尤为重要,但传统狂犬病疫苗仍存在单次免疫抗体水平低、维持时间短、生产成本高等问题,而针对人类、宠物和野生动物3个群体开发安全性高、副作用低、免疫效果优的新型疫苗,不但能解决传统狂犬病疫苗所存在的问题,同时也是实现世界卫生组织(World Health Organization,WHO)2030年消除人间狂犬病目标的关键手段。

1 传统狂犬病疫苗

传统狂犬病疫苗的发展已经历了3个阶段:动物神经组织疫苗、禽胚疫苗和细胞培养疫苗。动物神经组织疫苗是在19世纪80年代,由法国微生物学家巴斯德利用动物的中枢神经组织制备而成的狂犬病减毒疫苗,但该疫苗存在效力差、需要多剂量给药并伴有严重的不良反应等问题[3],如引发过敏性脑脊髓炎和其他神经组织并发症,易导致瘫痪和死亡等不良后果[4]。目前,WHO已建议不在临床中使用该疫苗。第2阶段为禽胚疫苗,如鸭胚疫苗(Duck embryo vaccine,DEV)和纯化鸭胚疫苗(Purified duck embryo vaccine,PDEV)等。DEV是将狂犬病病毒接种于适龄鸭胚的卵黄囊中进行培养,培养结束后提取病毒并将其上清液加以提纯和浓缩制备而成的狂犬病灭活疫苗[5]。与神经组织疫苗类似,禽胚疫苗也存在不良反应率高、免疫保护率低等问题,因此未得到推广应用[6]。第3阶段则为细胞培养疫苗,也是目前广泛应用的狂犬病灭活疫苗,如精制Vero细胞疫苗[7]和人二倍体细胞疫苗[8]等。此类疫苗具有副作用小、产生中和抗体快的优势,但却不能有效激活机体的细胞免疫,因此需要多次接种才能获得理想的免疫效果。

目前,我国人用的传统狂犬病疫苗以细胞培养疫苗为主(表1),但其存在生产工艺复杂、需多次免疫(4～5针)、免疫程序繁琐和佐剂辅助才能产生免疫效果等不足[9]。因此,研发安全性高、只需单次免疫的狂犬病疫苗是狂犬病疫苗未来的发展方向。

表1 我国人常用传统狂犬病疫苗信息Table 1 Information on traditional rabies vaccines commonly used in China

2 新型狂犬病疫苗研究进展

2.1 活载体疫苗 活载体疫苗是将免疫原基因与载体连接的重组载体转入受体,获得增殖培养物供疫苗制备,或直接将活载体接种宿主,能够直接在体内表达抗原诱导免疫反应的疫苗。G蛋白是诱导机体产生RABV中和抗体的唯一抗原,将G蛋白基因与特定的活载体连接即为狂犬病活载体疫苗。有研究显示,活载体疫苗能够显著提高抗原的免疫原性[10]。目前,用于狂犬病疫苗开发的活载体多为腺病毒。腺病毒载体具有宿主范围广、对人的致病性低和安全性高等多种优点,且能够激活机体的体液免疫和细胞免疫[11]。人腺病毒(Human adenovirus,hAd)是早先用于活载体疫苗开发的载体,但人体大多都曾经感染过腺病毒,从而存在腺病毒抗体,导致重组的腺病毒活载体疫苗在人体的免疫效果较差。因此,hAd作为载体开发的狂犬病活载体疫苗多作为口服疫苗用于野生动物的免疫,在野生动物狂犬病预防和控制方面具有广泛的应用前景[12]。

黑猩猩155型腺病毒(Chimpanzee adenovirus 155,ChAd-155)是从黑猩猩体内分离的一种野生型ChAd,与hAd有非常高的相似性,因此可以相同的受体进入宿主细胞。将RABV 糖蛋白(Glycoprotein,G)与ChAd-155相连后构建的狂犬病ChAd-155活载体疫苗(图1),在经肌肉免疫小鼠时,单次注射即能够产生很高的中和抗体滴度[高于0.5 IU/mL阈值的病毒中和抗体(Virus-neutralizing antibody,VNA)滴度],且具有明显的剂量效应[13]。此外,Wang等将RABV G蛋白与ChAd-68构建的活载体疫苗免疫比格犬,能够诱导机体产生特异性免疫反应,并且低剂量就可产生较高的中和抗体滴度[14]。Zhou等研究表明,RABV G蛋白与ChAd-68构建的活载体疫苗通过口服也能为小鼠提供免疫保护[15]。要实现WHO提出的消除狂犬病的目标,必需开发可对野生动物进行口服免疫的疫苗,提高野生动物的免疫覆盖率。以ChAd为载体构建的疫苗在诱导免疫反应的同时,可规避预先存在的针对人类腺病毒血清型的抗载体抗体的潜在问题[13],具备制成野生动物口服疫苗的潜力,成为了狂犬病活载体疫苗研发的重点载体之一。此外,利用犬2型腺病毒(Canine adenovirus 2,CAV-2)作为载体开发的兽用狂犬病疫苗也已经进行了大量的研究,将狂犬病G蛋白与CAV-2连接制备的狂犬病疫苗,接种后不但可以产生较强的免疫效果,还具有良好的遗传稳定性[16]。邱薇等的研究也表明,CAV-2活载体疫苗通过口服能使中华田园犬产生保护抗体[17]。

图1 RABV糖蛋白与ChAd-155连接后构建的疫苗模式图Fig.1 Schematic diagram of vaccine constructed by binding RABV glycoprotein to CHAD-155基因连接顺序不代表实际应用中的连接顺序;下图同The gene linking order does not regresent the actual linking order in practical application. The same as below

痘病毒(Pox virus)也是狂犬病疫苗研究的病毒载体之一,痘病毒不但对外源基因的容纳性较强,而且具有独特的强启动子,可增强外源基因转录和表达蛋白的效果。以山羊痘病毒(Goatpox virus,GPV)为病毒活载体,经同源重组获得能够表达狂犬病毒 G 蛋白的重组羊痘病毒,接种绵羊后所产生的G蛋白中和抗体虽然低于上海博湖生物科技有限公司的商品化灭活苗,但该结果揭示了痘病毒用于狂犬病活载体疫苗研究的可行性[18]。

目前,ChAd与G蛋白所构建的口服疫苗已应用于野生动物狂犬病的消除工作[15],而ChAd-155和痘病毒等狂犬病活载体疫苗仍处于研发或临床试验阶段[13],其研究对未来研发动物用甚至人用狂犬病疫苗都具有潜在的指导意义。

2.2 核酸疫苗 核酸疫苗包括DNA疫苗和RNA疫苗,其原理是将抗原基因与真核表达载体连接后导入机体,诱发机体对所表达的蛋白产生免疫反应,其优势在于既可激活机体的体液免疫又可诱发细胞免疫,且机体只对所插入的抗原产生免疫反应,因此降低了副作用的产生。

DNA疫苗易于构建和储存,因此目前狂犬病核酸疫苗开发以DNA疫苗为主[19]。研究显示,狂犬病DNA核酸疫苗免疫比格犬4周时产生的中和抗体平均滴度达到3.23 IU/mL,54周时产生的中和抗体平均滴度仍可达到2.88 IU/mL,均显著高于WHO所要求的0.15 IU/mL[20]。许永青通过删除G蛋白的跨膜区和胞内区,添加非甲基化的胞嘧啶鸟嘌呤二核苷酸寡脱氧核苷酸(CpG oligonucleotide CpG OND)佐剂,并结合电刺激的肌肉注射免疫动物,显著提高了抗原表达量,DNA质粒的细胞转化效率,从而增强了疫苗的传递效率、持续时间和免疫效果[21]。另外,通过壳聚糖纳米颗粒包裹DNA能够有效提高DNA疫苗的递呈能力,并且具有缓释作用(持续释放24 d),从而提升疫苗的免疫效果[22]。然而,核酸疫苗的质粒会长期存在于体内,存在导致宿主基因突变的风险,同时质粒基因组的抗性基因会随着DNA疫苗进入接种者体内,从而产生抗生素耐药性等问题[23]。

与其他疫苗相比,RNA疫苗具有其独特优势,如mRNA是非整合性平台,不存在感染或突变的风险,还可被细胞正常代谢降解,具有非常高的安全性;由于体外转录反应的高产性,mRNA疫苗还具有生产简便、成本低等优势[24]。然而,与其他狂犬病疫苗相比,狂犬病RNA疫苗的免疫保护力较低。表达狂犬病病毒G蛋白的RNA狂犬病病毒疫苗CV7201临床Ⅰ期试验结果显示,实验动物对该疫苗的耐受良好,但只有80%个体的抗体效价达到了免疫保护的要求,且大多数接种者均产生了不同程度的不良反应[25]。但最近的一项研究显示,自扩增RNA疫苗在狂犬病的临床试验中有较好的免疫保护效果,与传统mRNA疫苗(图2)相比,自扩增RNA疫苗在较低剂量下显示出较强的抗原表达[26]。因此,可通过深入研究自扩增狂犬病RNA疫苗,为今后RNA疫苗的研发提供理论支撑和数据支持。

图2 传统mRNA疫苗模式图Fig.2 Schematic diagram of the traditional mRNA vaccine

2.3 病毒样颗粒疫苗 病毒样颗粒(Virus-like particles,VLPs)是由病毒的一种或几种结构蛋白在体外以自主装配方式形成的蛋白粒子,具有模拟天然病毒的形态和结构、不含遗传物质、无感染和复制能力的优势[27]。VLPs以正确构象和高度重复的形式展示抗原表位,能够同时诱导体液免疫和细胞免疫,因此被应用到许多疫苗研究中。口蹄疫、猪流行性腹泻、流感等病毒样颗粒疫苗的成功研制,为狂犬病病毒样颗粒疫苗(RABV-VLPs)的研究提供了可行性参考[28]。RABV G蛋白作为唯一刺激并诱导机体产生VNA的结构蛋白,是制备RABV-VLPs的最主要蛋白之一。孙宏宇将G蛋白和基质(Matrix,M)蛋白作为构建RABV-VLPs的基本组成蛋白,鞭毛蛋白(Flagellin)和大肠杆菌不耐热肠毒素B亚基(Escherichia coli heat-labile enterotoxin B subunit,LTB)作为分子佐剂以膜锚定的形式嵌合在VLPs表面,形成与RABV相似的RABV-VLPs,通过肌肉注射免疫小鼠和犬,均诱导机体产生了显著的RABV特异性体液免疫反应和细胞免疫反应,能够有效产生抗体,并为免疫动物提供了有效的免疫保护(图3)[29]。此外,添加某些刺激因子也可提高RABV-VLPs的免疫效果。例如,与单独免疫RABV-VLPs相比,将粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor,GM-CSF)和RABV-VLPs疫苗同时注射小鼠,机体可产生更高的VNA滴度,证明GM-CSF对RABV-VLPs疫苗具有良好的辅助作用[30]。VLPs还能够共表达多种融合蛋白,例如,将口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus,FMDV)的中和表位G-H环插入到RABV-G形成新的VLPs,免疫小鼠后可产生抗狂犬病特异性抗体和口蹄疫中和抗体,其中口蹄疫中和抗体滴度与商业口蹄疫疫苗相似[31]。因此,RABV- VLPs具有开发成为更安全有效的新型动物用狂犬病疫苗的潜能。

图3 分子佐剂或融合蛋白嵌入VLPs疫苗模式图Fig.3 Schematic diagram of molecular adjuvants or fusion proteins embedded in VLPs vaccine

2.4 亚单位疫苗 亚单位疫苗是指利用重组DNA技术,将致病微生物保护性抗原基因片段重组到原核或真核表达载体,并实现病毒蛋白的表达。亚单位疫苗不是完整的病原体,没有感染能力[32]。狂犬病亚单位疫苗大多是基于RABV-G作为基础的免疫原,使得在制备狂犬病亚单位疫苗时不需要筛选保护性抗原[33]。大多数亚单位疫苗在制备时都会将生产方式简单、生产成本较低的大肠杆菌作为首选表达系统。然而,原核表达系统虽然能够成功表达G蛋白,但免疫效果差,其免疫动物后产生的抗体水平远低于商品苗[34]。使用杆状病毒表达载体系统可以很好的提高蛋白表达量,而且其产生的RABV-G在后续动物试验中也表现出较好的免疫效果[35]。以烟草叶片作为G蛋白表达系统,将G蛋白纯化后免疫小鼠,可为小鼠提供较高的免疫保护效力[36]。此外,通过替换G蛋白上的信号肽能够提高G蛋白的表达水平,研究显示,将G蛋白原始信号肽替换为人体IgG的信号肽,G蛋白表达水平可从几μg/L提高到50 mg/L[37]。

2.5 减毒疫苗 传统狂犬病减毒疫苗的制备方法是将RABV减毒株经传代后使其毒力降低,并且能够诱发良好的免疫应答而不产生临床症状。邹剑等[38]将RABV在豚鼠颌下腺连续传5代后获得的弱毒株免疫小鼠,结果显示,该弱毒株具有良好的免疫效果,并且具有良好的遗传稳定性,为制备兽用狂犬病口服弱毒活疫苗打下了基础。但减毒疫苗毒力的返祖现象仍然是目前减毒疫苗最值得关注的问题,而且具有一定活性和致病性的减毒疫苗对免疫功能低下者和孕妇都可能造成一定的影响。

为加快减毒疫苗的制备,提高其安全性,狂犬病减毒疫苗目前大多依靠反向遗传技术,对基因组进行基因突变、缺失和修饰。目前,大多数狂犬病减毒疫苗都是通过将G蛋白的氨基酸进行突变或引入其他氨基酸进行改造,形成狂犬病减毒疫苗。研究显示,在G蛋白中第333位氨基酸具有精氨酸(Arg)或赖氨酸(Lys)的菌株在接种后会使成年小鼠死亡,将该氨基酸进行突变后可使其致病性减弱,因此通过对G蛋白第333位氨基酸进行突变,是减毒疫苗制备的常用手段[39]。且突变形成的谷氨酸(Glu)残基需要2个核苷酸替换才能恢复为致病性Arg,降低了致病性逆转的可能性,但1个核苷酸取代足以将Glu残基转化为另一个致病残基Lys,从而导致致病性逆转,这表明突变减毒存在潜在的安全问题[40]。有研究表明,将狂犬病ERA株G蛋白第333位氨基酸(G333)处插入Arg或亮氨酸(Leu)所产生的ERA-G333Leu弱毒株免疫小鼠后,可产生较高的中和抗体,且毒力水平较低,表明通过在G333处引入其他氨基酸在开发具有高安全性的狂犬病减毒疫苗株中具有很高的效用[41]。

反向遗传技术操作系统在狂犬病减毒疫苗的制备中发挥着关键作用,通过定向突变改造病毒基因组,获得弱毒疫苗候选株,具备减毒途径明确、效率高、毒力回复率低等优点,是狂犬病减毒疫苗研制的新方向[42]。目前,所有狂犬病新型疫苗研发过程中,安全性问题均是首要问题,尤其是RABV的分离培养、疫苗制备和临床使用,需确保在防护恰当的情况下进行,甚至在生物安全实验室进行操作,以防止致病毒株向外扩散。因此,反向遗传技术所存在的毒力返强等安全性问题,是目前制约其发展的最大瓶颈。

3 展望

目前,新型狂犬病疫苗仍面临诸多问题,如核酸疫苗免疫效果不尽理想,病毒样颗粒疫苗的热稳定较差且存储困难,减毒疫苗在生产时对安全性要求极高,亚单位疫苗稳定性差且在细胞微环境中易降解等。针对此类问题已研究了一些解决方法,如在病毒样颗粒疫苗外增加一层矿物质外壳,既能提高VLPs的免疫效果,又能增强其耐热性[43];在核酸疫苗和亚单位的研发过程当中添加佐剂,以提高其免疫效果和稳定性[44];或通过提高生产过程中所需的安全水平来达到减毒疫苗生产过程中所需的高安全性。而针对人、宠物和野生动物3个群体开发安全性高、副作用低、免疫效果优的新型疫苗,是实现WHO 2030年消除人间狂犬病目标的关键手段,病毒样颗粒疫苗和核酸疫苗所具备的安全性和高效性是未来人用狂犬病疫苗研究的重点。对各种宠物进行免疫覆盖是降低人类狂犬病传播的关键步骤,制备简单、免疫效果优良的活载体疫苗和亚单位疫苗是未来开发廉价且高效的兽用疫苗的主要方向。但想从根本上控制狂犬病必须从源头进行控制,对野生动物进行群体免疫才是最有效的方法,多种新型疫苗所制备的兽用口服狂犬病疫苗是从源头控制狂犬病的最有力工具。因此,新型狂犬病疫苗的研究仍需进一步加深,加速开启狂犬病疫苗研究的新篇章。