河南部分地区不同免疫频次下猪圆环病毒2型流行病学调查

龚 婷,侯文静,马 辉,郑 鸣,苏玉贤

(1.河南牧业经济学院,河南 郑州 450046 ; 2.平顶山市畜牧技术推广站,河南 平顶山 467000)

猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV2)是导致断奶仔猪多系统衰竭综合征(Postweaning multisystemic wasting syndrome,PMWS)、猪皮炎和肾病综合征(Porcine dermatitis and nephropathy syndrome,PDNS)、母猪繁殖障碍(Peproductive failure)、猪呼吸道疾病综合征(Porcine respiratory diseases complex,PRDC)和仔猪先天性震颤(Congenital tremor,CT)等猪圆环病毒相关疾病(Porcine circovirus associated disease,PCVAD)的主要病原体[1,2]。自1991年在加拿大首次报道PMWS以来,许多国家和地区都有该病发生的报道[3-5]。2000年,郎洪武等[6]首次报道了我国部分地区猪场感染PCV2,近年来,我国多个省份陆续报道了猪场出现PCV2感染的病例[7,8],防控形势严峻复杂。PCV2主要侵害猪的淋巴组织器官,引起病猪免疫抑制,导致感染猪抗病力下降,容易共染或继发感染其他病原微生物[9],给养猪业造成重大经济损失。

目前,PCVAD尚无特效临床治疗药物,常规疫苗接种是预防和控制猪群感染PCV2的重要手段。经过多年发展,规模化养猪成为主要的饲养生产方式。尽管规模猪场精细化管理有利于PCV2防控,但是,猪群PCV2感染发病的情况依然不断发生。对猪群进行PCV2血清抗体监测和病原检测分析是评价疫苗免疫效果、了解病毒感染状况和制定免疫程序的主要指标,也是防控动物疫病的重要手段和制定有关政策的依据,可以更有效地预防疾病的发生。近几年来,河南省部分地区有关PCV2疫苗接种后猪血清抗体流行病学调查的报道较多,但针对不同免疫频次下PCV2疫苗免疫效果的研究罕见报道。为分析河南部分地区规模化猪场PCV2流行现状,了解不同免疫频次下猪群PCV2流行特点,本试验对2019—2021年采集的猪病料进行血清PCV2抗体和抗原核酸检测,以期为养猪场防控PCV2感染提供参考。

1 材料与方法

1.1 血清来源 2019—2021年,在河南新乡、平顶山、焦作等地区9家规模化猪场前腔静脉无菌采集猪全血1 454份,1份/头,分离血清,-20 ℃保存备用。规模化猪场PCV2免疫情况和血清来源信息见表1。

表1 规模化猪场PCV2免疫情况和血清来源信息Table 1 Information of PCV2 immunization status and serum sources in large-scale pig farms

1.2 主要试剂 PCV2抗体ELISA检测试剂盒,购自上海酶联生物科技有限公司;血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒、2×EasyTaq®PCR SuperMix和DL1 000 DNA Marker,均购自宝生物工程(大连)有限公司。

1.3 主要仪器 酶标仪,购自北京普朗新技术有限公司;基因扩增仪,购自珠海市祥臻生物科技有限公司;凝胶成像系统,购自伯乐生命医学产品(上海)有限公司。

1.4 引物 按照猪圆环病毒聚合酶链反应试验方法(GB/T21674—2008)[10]设计PCV2引物,引物序列:上游引物PCV2-F:5′-CCGCGGGCTGGCTGAA-3′,下游引物PCV2-R:5′-ACCCCCGCCACCGCTACC-3′,预扩增目的片段长度为 1 154 bp,引物使用浓度为10 μmol/L,引物由良培基因生物科技(武汉)有限公司合成。

1.5 血清PCV2抗体ELISA检测 PCV2抗体检测按照PCV2抗体ELISA试剂盒说明书操作。先用样本稀释液按1∶40倍稀释血清样本,然后37 ℃孵育30 min,洗涤5次,每孔加入100 μL羊抗猪酶标二抗,37 ℃孵育30 min,洗涤5次,每孔加入50 μL底物A液和B液,混匀避光显色10 min,最后每孔加入50 μL终止液,振荡60 min,10 min内在酶标仪上于450 nm波长处,以空白对照孔调零后,读取各反应孔吸光度(Optical density,OD)。当阳性对照OD450值≥0.50,阴性对照OD450值≤0.20时试验成立,计算结果判定:S/N 值≥2.10,判定血清样本PCV2 抗体为阳性;S/N 值<2.10,判定血清样本PCV2抗体为阴性。其中,S代表样本OD值,N代表阴性对照 OD值。

1.6 血清PCV2核酸PCR检测 取PCV2抗体阳性血清200 μL,按照血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒说明书操作提取DNA,以提取的DNA为模板,利用PCR方法检测PCV2。PCR反应体系:2×TaqPCR Master Mix 10 μL,上、下游引物各1 μL,模板2 μL,补足ddH2O 至20 μL。PCR反应程序:95 ℃ 5 min;95 ℃ 30 s,55 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,共 30个循环;72 ℃ 10 min。PCR扩增产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳检测,凝胶成像系统下观察结果。

1.7 免疫密度指标计算和受检猪群不同免疫情况分组 根据规模化猪场2019—2021年受检猪群的 PCV2疫苗免疫记录情况,按公式(1)计算每年PCV2 疫苗免疫密度。

免疫密度(%)=年已免疫PCV2疫苗的样本数÷年样本总数×100%

(1)

根据受检猪群的PCV2疫苗免疫不同频次,将受检猪群分为3个组,分别为未免疫组、免疫1次组、免疫≥2次组,通过分析比较各组猪群的血清PCV2抗体阳性率和核酸阳性率,揭示不同免疫频次与猪群PCV2抗体阳性率之间的关系。

1.8 数据统计分析 利用SPSS 20.0软件进行方差分析,统计分析不同年份抗体阳性率、免疫密度,以及不同免疫频次下PCV2抗体阳性率和核酸阳性率。采用Bonferroni矫正χ2方法检验差异显著性,P<0.05为差异显著,P>0.05为差异不显著。

2 结果

2.1 2019—2021年不同免疫密度下血清PCV2抗体阳性率 由表2可知,2019—2021年共检测血清样本1 454份,检出抗体阳性样本894份,总抗体阳性率为61.5%(894/1454),免疫样本1 052份,免疫密度为72.4%(1 052/1 454)。2019年血清抗体阳性率和免疫密度分别为77.9%、91.1%,均显著高于2020年和2021年(P<0.05)。结果表明,随着免疫密度增大,PCV2抗体阳性率也随之提高。

表2 2019—2021年PCV2疫苗免疫密度和血清抗体阳性率Table 2 PCV2 vaccine immunization density and serum antibody positive rate from 2019 to 2021

2.2 不同免疫频次下血清PCV2抗体阳性率 由表3可知,未免疫组、免疫1次组和免疫≥2次组猪血清PCV2抗体阳性率分别为15.9%、74.2%和84.8%,未免疫组猪血清PCV2抗体阳性率显著低于免疫1次组和免疫≥2次组(P<0.05),而免疫1次组和免疫≥2次组之间猪血清PCV2抗体阳性率差异不显著(P>0.05);所有免疫猪的血清抗体平均阳性率为78.6%(831/1 057),显著高于未免疫猪的血清抗体阳性率(15.9%,63/397)(P<0.05)。结果表明,未免疫猪场存在PCV2感染,随着免疫次数增多,PCV2抗体阳性率相应升高,增加免疫频次可以显著提高血清PCV2抗体阳性水平。

表3 不同免疫频次下血清PCV2抗体阳性率Table 3 Serum PCV2 antibody positive rate under different immunization frequencies

2.3 血清PCV2核酸PCR检测 由表4可知,利用常规PCR方法对ELISA检测出的894份抗体阳性血清进行PCV2核酸检测,获得106份PCV2核酸阳性血清,平均核酸阳性率为7.3%(106/1 454);未免疫组、免疫1次组和免疫≥2次组猪血清PCV2核酸阳性率分别为13.6%、5.0%和4.8%,免疫1次组和免疫≥2次组的PCV2核酸阳性率均显著低于未免疫组(P<0.05),免疫1次组的核酸阳性率高于免疫≥2次组,但两组差异不显著(P>0.05)。结果表明,未免疫猪场PCV2感染比较严重,低水平PCV2抗体的猪群存在野毒感染的风险;随着免疫频次的增加,PCV2核酸阳性率呈下降的趋势,这可能与PCV2疫苗免疫猪的抗体水平升高对 PCV2 抵抗力增强有关。

表4 不同免疫频次下血清PCV2核酸阳性率Table 4 Serum PCV2 nucleic acid positive rate under different immune frequencies

3 讨论

3.1 2019—2021年河南部分地区PCV2疫苗免疫形势 在尚无特效药物治疗PCV2感染的情况下,有效的疫苗免疫接种是预防猪感染PCV2的主要手段,可以降低猪的病死率和发病率,提高猪的生产性能和养殖效益。因此,加强疫苗接种,提高免疫密度和血清阳性抗体水平,对于降低猪场PCV2感染风险,防控疫病流行具有关键作用。但是,本次调查中发现,每个猪场都曾经出现过免疫失败的情况。在本次调查期间通过询问畜主、查阅免疫记录等方式了解到,免疫抑制病原的存在、疫苗质量不良、疫苗保存不当、操作错误、免疫程序不科学等是造成免疫失败的原因。因此,为了防止免疫失败情况的出现,必须及时监测免疫动物抗体水平,最好在免疫接种前、后分别对动物采血进行抗体水平检测,并进行对比,及时了解免疫效果。本次调查对收集的1 454份血液样本进行ELISA抗体检测,结果发现,2019—2021年血清PCV2抗体阳性率分别为77.9%、39.3%和34.7%,血清PCV2抗体阳性率逐年降低,同时,免疫密度由2019年的91.1%下降到2021年的39.4%,表明血清抗体阳性率与免疫密度下降有关。分析其原因,除疫苗运输、购买和使用受到新冠肺炎疫情影响外,疫苗价格居高不下、猪价低迷、免疫接种操作不规范、防疫意识较低等也可能是造成免疫密度下降的重要原因。

3.2 不同免疫频次下血清PCV2抗体阳性率分析 本次调查中未免疫组、免疫1次组和免疫≥2次组猪血清PCV2抗体阳性率分别为15.9%、74.2%和84.8%;免疫猪的抗体平均阳性率显著高于未免疫猪的抗体平均阳性率(P<0.05)。连慧香等[11]报道显示,2014—2016年豫南地区免疫猪场的PCV2抗体阳性率(72.57%)高于未免疫猪场的PCV2抗体阳性率(35.56%)。罗丽华等[12]对陕西部分猪场进行PCV2抗体检测发现,免疫猪场血清PCV2抗体阳性率为85%,非免疫猪场为43%。潘奕凡等[13]研究发现,猪场PCV2疫苗免疫在未免疫、免疫1次和免疫≥2次情况下,PCV2抗体阳性率分别为32.4%、66.0%和86.5%。周华林等[14]报道显示,PCV2疫苗双针免疫组效果明显优于单针免疫组,可显著降低猪发病率和死亡率。这些研究结果与本调查结果基本相一致,表明随着免疫频次的增加,血清抗体阳性水平升高,有利于提高猪机体抵抗PCV2的能力,降低感染概率。

3.3 血清PCV2核酸PCR检测分析 尽管疫苗是有效防控PCVAD的主要手段,但是不能清除猪机体内已感染的PCV2,无法彻底阻断PCV2流行,不能防止野毒感染[15],猪的PCV2抗体水平不能准确反映猪场PCV2感染的实际情况。这可能与PCV2主要寄生在淋巴免疫细胞,并且抗体无法有效突破固有的免疫屏障有关[16-18]。因此,需要检测机体内是否存在PCV2,才能了解猪场PCV2流行特点,进而实施有效的防控措施。PCV2核酸阳性猪可能处于隐性感染状态,一旦产生其他诱发因素或者致病因子、免疫功能严重抑制,则可能很快发病。而这些隐性感染的带毒猪可通过分泌物和排泄物持续排毒,使病毒在猪群中长期存在[19]。本调查结果显示,1 454份血清样本中有106份为PCV2核酸阳性,阳性率为7.3%(106/1 454);其中,未免疫组、免疫1次组和免疫≥2次组猪群的PCV2核酸阳性率分别为13.6%、5.0%和4.8%;免疫猪场PCV2核酸阳性率显著低于未免疫猪场PCV2核酸阳性率,且增加免疫频次后PCV2核酸阳性率有下降的趋势。这可能与疫苗免疫提高猪机体PCV2阳性抗体水平,增强抵抗力有关。提示应强化PCV2疫苗免疫,尽量增加免疫频次,延长抗体在机体内存留时间,以降低猪场发生PCV2感染的风险。

综上所述,本试验对2019—2021年不同免疫频次和免疫密度猪群进行PCV2感染情况调查,结果显示,河南部分地区猪场PCV2疫苗免疫密度和抗体阳性率呈现逐年下降趋势,未免疫猪PCV2核酸阳性率显著高于免疫猪。因此,PCV2防控形势不容乐观,应引起重视,可通过增加免疫次数以提高PCV2抗体水平,从而降低PCV2核酸阳性率,减少猪感染PCV2的风险。