穿膜肽修饰的PHBHHx负载紫杉醇递药系统构建

刘焕迪， 杜 洁， 张红蕾， 张路路， 李 玮

（1.河北大学药物化学与分子诊断教育部重点实验室，化学国家级实验教学示范中心，化学与材料科学学院，河北 保定 071002；2.河北牧群生物科技有限公司，河北 保定 071002）

0 引言

紫杉醇（Paclitaxel，PTX）是一种从红豆杉属植物的树皮中提取分离出来的具有广谱抗癌活性的二萜类化合物［1］，是继阿霉素和顺铂之后的一类新型抗癌药物，广泛用于乳腺癌、卵巢癌、非小细胞肺癌、膀胱癌、前列腺癌、黑色素瘤、食管癌等多种肿瘤的治疗［2-4］。然而，PTX在临床应用上的治疗效果因其疏水性、高毒性和低生物利用度而受到限制［5］。研究人员利用脂质体［6］、壳聚糖［7］、聚合物胶束［8］等作为载体递送紫杉醇，具有增加药物稳定性和延缓药物释放，实现药物靶向输送的设计优势。但是，递送载体本身存在生物相容性差，降解产物导致正常细胞炎性等问题，影响其在临床上的广泛应用。因此选择一种安全无毒且有效的递送载体，对PTX 新制剂具有重要的临床意义。

聚羟基脂肪酸酯（Polyhydroxyalkanoates，PHA）是一类由多种微生物胞内发酵合成的生物可降解高分子材料，具有良好的生物可降解性、生物相容性，被广泛应用在生物医学领域［9］。3-羟基丁酸-3-羟基己酸共聚酯（3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyhexanoate，PHBHHx）是PHA家族在生物医学领域应用中较为广泛的一种，其降解产物对细胞和组织没有任何毒性［10］。已有研究利用PHBHHx 作为载体对雷帕霉素［11］、阿霉素［12］进行递送，表现出了优异的生物相容性及药物缓释效果。

本文以生物可降解材料PHBHHx 包载疏水性药物PTX，制备可安全降解的PHBHHx负载PTX（PTX@PHBHHx）纳米微球。并对所制备的纳米微球的尺寸、包封率和载药量进行评估与优化。将具有强穿膜特性的富精氨酸多肽（Arginine-rich polypeptide，RALA）与PHA 颗粒表面结合蛋白［13］（Polyhydroxyalkanoates granule binding protein，PhaP）进行融合表达并纯化获得融合蛋白（PhaP-RALA）。PhaP-RALA 与PTX@PHBHHx纳米微球通过自组装的方式相结合，构建穿膜肽修饰的PHBHHx负载PTX药物递送系统（PTX@PHBHHx-PhaP-RALA）。

1 实验部分

1.1 实验试剂与仪器

（1）试剂。PTX（98%），麦克林；PHBHHx（99.4%），北京蓝晶微生物；吐温-20（99%）、氨苄青霉素（99%），BBI 生命科学；聚乙烯醇（Polyvinyl alcohol，PVA）（97%），天津大茂；曲拉通X-100（TritonX-100）（99%）、聚丙烯酰胺（99%）、BCA 蛋白浓度检测试剂盒，生工生物工程；甲醇（光谱纯）、乙腈（光谱纯）、二氯甲烷（光谱纯）、碳酸氢铵（分析纯），天津科密欧；油酸钠（98%），安耐吉；HisTrapTMHP、HisTrapTMDesalting预装柱，德国通用。

（2）仪器。Nano Brook Omini 动态光散射仪（Dynamic Light Scattering，DLS），美国布鲁克；AKTA Pure蛋白纯化系统，德国通用；Dionex Ultimate 3000 高效液相色谱仪（High Performance Liquid Chromatography，HPLC），美国赛默飞；JSM-7500F扫描电子显微镜（Scanning Electron Microscope，SEM），日本电子；Tecnai G2 F20S-TWIN 透射电子显微镜（Transmission Electron Microscope，TEM），美国FEI公司；JB-2 双向磁力加热搅拌器，江苏金坛荣华仪器；LYNX 6000 大型离心机，美国赛默飞；Centrifuge5424 R小型离心机，德国艾本德；N-1100 旋转蒸发仪，东京理化；BT125D电子天平，德国赛多利斯；JY 92-IIND超声波粉碎机，新芝；FDU-2110 冷冻干燥机，东京理化；NanoDRop 2000C超微量分光光度计，美国赛默飞。

1.2 PTX@PHBHHx纳米微球制备及优化

（1）利用乳化溶剂挥发法制备PTX@PHBHHx 纳米微球。称取1 mg PTX和50 mg PHBHHx，置于7 mL二氯甲烷中，超声30 min 使其溶胀并溶解；将上述混合溶液，缓慢滴加入60 mL 1% PVA 溶液，随后加入0.5 ml 吐温-20 采用超声波粉碎机超声混匀；用旋转蒸发仪在42 ℃条件下除去残余二氯甲烷；将残留的浓缩液体置于大型离心机12000 r/min 下离心20 min，收集沉淀，用蒸馏水洗涤3 次；将沉淀置于冷冻干燥机中进行干燥，得到PTX@PHBHHx 纳米微球。操作过程中，曲拉通X-100（TritonX-100）、吐温-20 二者中对比选择乳化效果好的油相乳化剂，对其用量进行调整；由PVA、碳酸氢铵、油酸钠三者中对比选择乳化效果好的水相乳化剂，并对其浓度进行调整。以上用以优化微球尺寸及粒度分布。分别用1∶3、1∶5、1∶7、1∶10、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60 比例调整PTX 和PHBHHx，进行药物的包封率及载药量的优化。

（2）PTX@PHBHHx纳米微球的DLS表征。取50 μL组装完毕的微球于2 mL EP管中，用PBS定容至2 mL后，转入5 mL 的比色皿中，用DLS 对该样品粒度及尺寸分布进行检测。

（3）PTX@ PHBHHx 纳米微球包封率、载药量的测定。为确定PTX@ PHBHHx 纳米微球装载PTX 的能力，用HPLC，建立PTX 浓度标准曲线，来检测PTX的浓度。色谱条件：流动相采用乙腈和水溶液，在比例为55∶45 的等度条件下洗脱，流速为1 mL/min，柱温为30 ℃，检测波长为270 nm，进样量为20 μL。精确称取PTX对照品1.5 mg 于棕色容量瓶中，加入甲醇溶解，并定容至25 mL制得浓度为60 mg/L的储备液；对母液逐级稀释分别得到浓度为60、30、15、7.5、3.75、1.875、0.938、0.469 mg/L 的系列标准溶液，并于4 ℃保存备用；采用外标法，分别对PTX 各浓度的标准溶液进行检测，根据检测结果绘制PTX浓度的标准曲线；并通过下式计算PTX的包封率（Encapsulation Efficiency，EE）和载药量（Loading Content，LC）［14］：

式中：Wt为PTX的投药量；C为上清中药物浓度；V为本批次制剂总体积；Ws为载药微球总质量。

1.3 PTX@PHBHHx纳米微球的功能化修饰

（1）PhaP-RALA 的制备。将实验室表达PhaPRALA的大肠杆工程菌株E. coli BL21（DE3）/phaprala的冻存液［15］置于冰上使其融化，并将其以1%接种量接种于含1‰氨苄青霉素（50 mg/mL）的培养基中，37 ℃，200 r/min孵育12 h后进行扩大培养并进行低温诱导，实现PhaP-RALA 在大肠杆菌的表达；将表达PhaP-RALA 的菌液进行收集、洗涤后超声破碎，然后使用大型低温离心机12000 r/min 下20 min，收集上清，使用His TrapTMHP 预装柱（1 mL）进行梯度洗脱、纯化；用His TrapTMDesalting 预装柱进行脱盐处理，收集脱盐后的PhaP-RALA，取10 μL加等体积的上样缓冲液，100 ℃加热15 min，用12% SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-Poly Acrylamide Gel Electrophoresis，SDS-PAGE）进行纯度分析。剩余蛋白储存于4 ℃备用。

（2）PTX@PHBHHx-PhaP-RALA 的自组装。取2 mL 纯化后的PhaP-RALA 蛋白液与1 mg PTX@PHBHHx纳米微球混合后，低温低速搅拌过夜，结合完毕后使用小型离心机13000 r/min 下15 min，收集沉淀，得到PTX@PHBHHx-Phap-RALA。将沉淀用1 mL磷酸盐缓冲液重悬，低温保存。

（3）PTX@PHBHHx-PhaP-RALA 的SEM、TEM 表征。取50 μL样品沉积在硅片表面上，过夜干燥后，在电压为15 kV 条件下，用SEM 放大40000 倍进行观察。取50 μL样品沉积在铜网上表面上，干燥后，用1%负染液进行负染，并用蒸馏水洗涤，过夜干燥，在电压为80 kV条件下，用TEM放大40000 进行倍观察。

2 实验结果与讨论

2.1 乳化剂对PTX@PHBHHx纳米微球尺寸的影响

在乳化溶剂挥发法制备微球的过程中，乳化分散剂的种类及用量对液滴的分散稳定性有着重要作用。吐温-20 与TritonX-100 作为水包油型乳化剂、稳定剂能够使纳米粒子之间产生排斥力，从而阻止粒子之间的团聚。本实验对比了吐温-20 与TritonX-100 作为乳化剂的乳化效果，TritonX-100 乳化效果差、颗粒团聚明显。

（1）不同吐温-20 用量对纳米微球粒度及尺寸分布的影响。当吐温-20 用量分别为0.5、1、2 mL时获得的微球尺寸及分布分别为（159.3 ±3.2）、（2880.5 ±1987.6）、（6663.6 ±5170.2）nm，结果表明：随着吐温-20 用量的增加，微球的粒径也随之增加，用量为0.5 mL 时粒径最小为150 nm 左右，分散性、均匀性更好。

（2）水相乳化剂影响。水相中的乳化分散剂能起到增加水相的黏度，防止乳滴沉降的作用，其吸附在乳滴的表面，降低乳滴表面张力，防止微球团聚，也会对微球的尺寸及粒度分布产生影响，本实验分别采用PVA、碳酸氢铵、油酸钠3 种常见的水相乳化剂来制备微球，所制备微球粒度及尺寸分布分别为（159.3 ±3.2）、（26117.6 ±9409.5）、（436.4 ±25.2）nm，结果表明：当水相乳化剂采用为PVA时，效果最佳，微球粒径最小，分散度、均匀性最好。

（3）不同浓度的PVA对微球粒径及分布的影响。PVA质量浓度分别采用1%和0.1%，所制备微球粒度及尺寸分布分别为（159.3 ±3.2）nm 和（1267.01 ±143.6）nm，结果表明：0.1% PVA条件下，活性剂浓度低，导致微球粒径大于1 μm，而1% PVA条件下微球粒径维持在160 nm 左右，故此选择1% PVA 为最佳用量。

2.2 PTX@PHBHHx纳米微球包封率及载药量评价

（1）PTX浓度检测及标准曲线。使用超微量分光光度计在200 ～800 nm 波长范围内对PTX 样品进行紫外扫描，考察药品的紫外吸收情况，得到PTX 最大吸收波长为270 nm。为确定PTX@ PHBHHx 纳米微球对PTX的包封能力和载药能力，采用HPLC 检测方法对PTX标准品进行检测，液相结果如图1 所示。由图可知，保留时间T在7.420 min时峰为PTX的峰，峰面积最大，峰形呈高斯对称；相同色谱条件下，以进样质量浓度为x轴，PTX的峰面积为y轴，绘制不同浓度的PTX溶液曲线，并对PTX溶液曲线进行线性回归拟合，获得PTX溶液标准曲线如图2 所示。获得的线性方程为y=0.7298x+0.2974，线性回归系数R2=0.999 4，表明PTX标准曲线线性关系良好，方法重现性优，精密度高。

图1 PTX液相色谱图

图2 PTX溶液标准曲线

（2）包封率与载药量的优化。采用外标法对PTX@PHBHHx 纳米微球中PTX 组装前后的浓度进行测试，利用差值法计算装载材料与药物添加量在不同比例条件下药物的EE及LC，对PHBHHx与PTX添加量的配比进行优化，结果见表1 所列。由表可见，随着二者比例的增加，包封率及载药量呈现出先增加后降低的趋势，当PTX与PHBHHx反应比例为1∶50 时，药物的包封率与载药量达到最优，PTX 的包封率为81.02%，载药量为50.9 mg/g。

表1 药物与装载材料配比对包封率、载药量的影响

2.3 PhaP-RALA的纯化

实验室保存的工程菌株E. coli BL21（DE3）/phap-rala经过诱导表达后，得到可溶性目的蛋白。使用蛋白纯化系统经亲和层析、脱盐、浓缩进行纯化后，经SDS-PAGE分析检测，结果如图3 所示：蛋白条带大小与目的蛋白PhaP-RALA相对分子质量（24 kg/mol）大小相同且条带单一，可用于后续实验。

图3 PhaP-RALA的SDS-PAGE图

2.4 PTX@PHBHHx-PhaP-RALA 的自组装与形貌表征

PhaP-RALA 与PTX@ PHBHHx 纳米微球低温经夜结合，通过自组装获得PTX@PHBHHx-PhaP-RALA。用SEM和TEM对PTX@PHBHHx-PhaP-RALA的粒径大小和形貌进行了表征，其结果如图4 所示。由图4可知，载药系统分散度较好，基本呈球形，表面负载蛋白使表面略显粗糙，粒径约为150 nm；载药系统出现中间颜色深，周围颜色淡的现象，这也进一步证实了疏水性药物PTX被包裹在高分子材料PHBHHx中。

图4 PTX@PHBHHx-PhaP-RALA粒径和形貌照片

3 结语

本文利用乳化-溶剂挥发法将PTX 负载在PHBHHx上，制备出PTX@PHBHHx纳米微球；利用转基因技术获得PhaP-RALA，并成功修饰在PTX@PHBHHx纳米微球表面，构建出生物可降解PTX@PHBHHx-PhaP-RALA。通过DLS 对不同条件下获得的纳米微球尺寸及分布进行了研究，通过HPLC 测量残余PTX 的浓度并利用差值法计算获得最优药物与装载材料的比例，并通过SEM、TEM 对递药系统的大小与形貌进行了表征，结果表明：当采用0.5 mL 的吐温-20、60 mL（1%）PVA 作为乳化剂制备PTX@PHBHHx纳米微球时，微球尺寸达最小为150 nm，均匀性良好；药物与装载材料比例为1∶50 时药物包封率及载药量最优，分别为81.02%和50.9 mg/g；所构建递药系统尺寸在150 nm 左右，颗粒小、分散性好。该递药系统的设计对解决PTX 及其载药体系生物相容性差、药物利用度低的问题有现实意义。