PAK5激酶促进肺结核患者外周血单核细胞活化

郑高明 金育娇 范超明

近年来，结核病（tuberculosis，TB）发病呈上升趋势，包括艾滋病在内的免疫力低下人群以及重症监护室耐药菌感染者是TB 发病的高危人群。世界卫生组织发布的《2022 年全球结核病报告》显示，2021 年全世界新发TB 患者1060 万例［1］。我国估算的新发结核病患者数为78.0 万，占全球结核病例的7.4%。结核分枝杆菌（mycobacterium tuberculosis，MTB）是结核病的病原体，单核巨噬细胞是消灭MTB 的“前线细胞”，活化的单核巨噬细胞吞噬并分解MTB，将MTB 抗原呈递给T细胞，启动细胞免疫。但MTB 能通过各种机制长期隐匿在单核巨噬细胞内，二者之间的斗争决定着疾病的转归［2］。p21 活化激酶5（PAK5）是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，通过与广泛的细胞内蛋白相互作用参与多个信号转导通路，调节细胞活化、增殖、迁移等［3］。MTB感染患者时，单核细胞活化与PAK5 蛋白的关系尚不清楚。本文旨在评估肺结核患者外周血单核细胞活化与PAK5 的相关性，为借助PAK5 增强单核细胞活性辅助治疗结核病提供依据。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2017 年10 月至2023 年5 月杭州师范大学附属医院65 例确诊为活动性肺结核患者（结核组），以及65 例健康体检者（对照组）。结核组纳入标准：年龄≥18 岁的活动性肺结核患者；排除标准：免疫缺陷者、糖尿病、心血管疾病、其它感染性疾病和肿瘤。活动性结核是基于结核病相关的临床症状和体征，及结核分枝杆菌病原学、病理学、影像学等检查有活动性结核诊断的证据，所有患者通过痰培养出结核分枝杆菌确诊。结核组中男45 例，女20 例；年龄（51±20）岁。对照组中男35 例，女30 例；年龄（32±10）岁。

1.2 方法 （1）血常规检测：空腹采集EDTA-K2 抗凝外周血，采用迈瑞BC-6900 全自动血液分析仪（迈瑞，中国）检测白细胞数量，检测按仪器规程进行。（2）流式细胞术检测：取EDTA-K2 抗凝全血100μL 加至流式分析管，溶血后洗涤，加入PBS 10μL、 5×Binding buffer 2.5μL，CD45-FITC 0.5μL，CD14-APC 0.5μL，HLA-DR-PB 荧光抗体0.5μL（BioLegend，美国），室温避光孵育15 min，再加入二抗，室温避光孵育30 min，流式细胞仪（Navios，Beckman Coulter，美国）上机检测单核细胞数量和比例。细胞固定后行透膜处理，加入PAK5 一抗（Abnova，中国台湾）或兔源IgG 同型对照抗体（Invitrogen，美国），室温避光孵育30 min，加入山羊抗兔IgG-AF488 二抗（Thermo，美国），室温避光孵育30 min，流式细胞仪上机检测单核细胞内PAK5 蛋白。（3）荧光定量PCR 检测：①单核细胞分离：取新鲜EDTA 抗凝全血2.5 mL，加入等体积PBS 稀释全血；在15 mL 离心管中加入5 mL Ficoll 分离液（Biochrom，Germany），4℃ 1,000 g 离心30 min；吸取血浆与分离液之间的白膜层细胞至15 mL 离心管中，加入PBS 10 mL洗涤白膜层细胞，4℃ 250 g 离心10 min，弃上清液；加入Percoll 分离液4 mL（1.8 mL Percoll + 2 mL Minimal Essential Medium Eagle + 0.2 mL 10×Earle Balanced Salt Solution，Pharmacia，Germany），4℃ 420 g 离心30 min，收集中间层富集的单核细胞。②单核细胞RNA 提取和定量PCR：采用核酸提取纯化试剂盒（湖南圣湘公司，中国），按说明书要求提取并纯化单核细胞总RNA。采用TAKARA 逆转录试剂盒（RR037A），按说明书要求进行RNA 逆转录反应。采用TAKARA 定量PCR 试剂盒（RR820A），按说明书要求进行荧光定量PCR 反应，获得靶基因PAK5 和ACTB（内参基因）的Ct 值，并计算2-ΔΔCT值进行统计学分析。相关引物序列见表1。

表1 荧光定量PCR使用的引物

1.3 统计学分析 采用SPSS23.0 统计软件。正态分布的计量资料采用（±s）表示，两组比较用t检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 单核细胞比例及单核/淋巴细胞比值 与对照组比较，结核组外周血中单核细胞占全部白细胞的比例11.1%±2.3%高于对照组单核细胞占比5.3%±1.4%，结核组外周血中单核/淋巴细胞比值（0.49±0.20）高于对照组单核/淋巴细胞比值（0.16±0.05），差异均有统计学意义（t=13.452，P＜0.001；t=9.870，P＜0.001）。见图1。

图1 两组外周血单核细胞比例和单核细胞/淋巴细胞比值

2.2 单核细胞活化比和活化数 结核组单核细胞活化比93.9%±4.6%高于对照组单核细胞活化比72.9%±15.2%，结核组单核细胞活化数（970±334）个/L 高于对照组（281±149）个/L，差异均有统计学意义（t=8.258，P＜0.001；t=11.511，P＜0.001）。见图2。

图2 两组外周血单核细胞活化比和活化数

2.3 活化单核细胞的PAK5 蛋白表达阳性率 结核组活化单核细胞PAK5 蛋白表达阳性率84.71%±11.15%高于对照组75.33%±11.64%，差异有统计学意义（t=2.207，P=0.035）。见图3。

图3 两组活化单核细胞PAK5蛋白表达阳性率

2.4 活化单核细胞PAK5 基因mRNA 表达水平 结核组活化单核细胞PAK5 mRNA 表达水平（0.97±0.06）高于对照组（0.16±0.07），差异有统计学意义（t=7.519，P＜0.001）。见图4。

图4 两组活化单核细胞PAK5基因mRNA表达水平

3 讨论

结核病是严重威胁全球公共卫生的重大传染病，防治形势日趋严峻。MTB 是导致结核病的病原体，而单核巨噬细胞是机体抵抗MTB 感染的主要效应细胞。活化的单核巨噬细胞不仅可启动固有免疫应答，分泌炎性因子杀伤或直接吞噬MTB，还可以通过抗原递呈作用，激活获得性免疫应答［2］。机体感染MTB 后，单核细胞可经MCP-1、IFN-γ、TNF-α 等细胞因子刺激而活化，并向感染部位聚集，进入组织发育为组织特异性巨噬细胞，获得强大的吞噬杀菌能力，从而清除或携带MTB［4］。脂阿拉伯甘露聚糖（lipoarabinomannan，LAM）是MTB 细胞壁的一种糖脂，可与单核细胞膜上的Toll样受体2（TLR2）结合，激活细胞内多条信号通路，诱导单核细胞向巨噬细胞转化［5］。而在感染早期，MTB分泌的小分子抗原CFP10、ESAT6 等也可与单核细胞表面结合，激活相应的信号通路而活化单核细胞［6］。活化的单核巨噬细胞首先吞噬MTB，然后迁移至局部淋巴结，表达和通过MHC 分子递呈抗原而激活T 细胞［7］，但MTB 也可以阻碍单核巨噬细胞抗原递呈［8］，这些单核巨噬细胞不能杀灭细胞内的MTB，且其显著的迁移能力将有助于MTB 从感染部位向其它组织播散［9］。有研究发现，单核细胞膜上表达的模式识别受体，能帮其识别MTB 病原体相关分子模式而使其激活，活化后的单核巨噬细胞增加表面MHC I、MHC II 及协同刺激分子的表达，导致MTB 抗原更好递呈给T 细胞，使得T 细胞对MTB 发挥更有效的杀伤作用［10］。同时活化的单核巨噬细胞也能通过产生一氧化氮（NO）、促进吞噬小体向吞噬溶酶体及自噬溶酶体成熟等发挥着抗结核作用［11］。因此，单核细胞的活化对于机体清除MTB 非常重要。单核细胞活化的表面标志物主要是HLA-DR、CD25、CD69 等。本研究结果显示，结核患者外周血中单核细胞膜上的HLA-DR 等活化标志物的表达阳性率高于体检健康者，提示结核患者单核细胞活化比更高，结核分枝杆菌可以通过某种信号通路激活单核细胞，诱导其向巨噬细胞分化，进而参与机体对MTB 的杀灭和清除。

PAK5 是一个重要的信号转导分子，在多条信号转导通路中发挥作用。研究表明，单核细胞活化与p65-NFκB 通路激活密切相关［12］，提示PAK5 蛋白可能通过磷酸化p65-NFκB，促进HLA-DR 表达而活化单核细胞。本研究中，活动性肺结核患者的外周血中单核细胞比例增高，这个现象可能是由于结核病时，血循环中的单核细胞被激活而募集到肺部形成肉芽肿来控制MTB 感染所致。此外，活动性肺结核患者单核细胞与淋巴细胞比值也增高，这可能是由于MTB 感染人体后，骨髓造血干细胞有着向髓系分化的倾向，导致髓系及淋巴系比例增高［13］。与体检健康者相比较，活动性肺结核患者外周血中的活化单核细胞的PAK5 蛋白表达阳性率增高，同时PAK5 基因mRNA 表达水平增高，这进一步提示PAK5 蛋白参与单核细胞活化，诱导单核细胞向巨噬细胞分化增殖，并向感染灶迁移，发挥消灭MTB 的生物学功能。

综上所述，活动性肺结核患者单核细胞比例、单核细胞活化比和活化数、PAK5 蛋白表达阳性率和PAK5基因mRNA 表达水平均增高，提示结核分枝杆菌感染时，PAK5 蛋白具有促进单核细胞向活化单核细胞转变的潜能，这为今后通过PAK5 蛋白增强单核细胞功能控制结核病提供可能，且为目前抗结核辅助治疗提供新的方向。