Ⅰ型神经纤维瘤病相关的新的移码突变病例报道及文献复习

刘睿钦,孟华星,侯佳琪,张美妮△

(1.山西医科大学第一临床医学院,太原 030001;2.山西医科大学第一医院神经内科,太原 030001)

神经纤维瘤病是一种罕见的基因突变引起的常染色体显性遗传病,影响神经、肌肉、骨骼、内脏器官、皮肤和其他系统,神经系统肿瘤是该病的特征表现,最常见的类型是Ⅰ型神经纤维瘤病(neurofibromatosis 1,NF1)和Ⅱ型神经纤维瘤病。NF1占85%～90%,其特征是神经纤维瘤、咖啡斑、雀斑和视神经胶质瘤。Ⅱ型神经纤维瘤病主要表现为双侧前庭神经鞘瘤和脑膜瘤[1]。

NF1的发病率为1/3 000～1/2 000,患者容易发生中枢神经系统和外周神经系统的良性和恶性肿瘤,与该疾病相关的神经系统肿瘤包括视神经胶质瘤、胶质母细胞瘤、恶性周围神经鞘瘤和横纹肌肉瘤等。患者的预期寿命约比健康人少15年,主要死亡原因是恶性肿瘤、心血管意外和脑卒中[2]。该病尚无根治手段,主要是对症治疗,因此,完善基因检测对于早期诊断和预防家系遗传有重要意义。

NF1基因于1990年被发现,该肿瘤抑制基因位于17q11.2染色体上,包含58个外显子,编码神经纤维蛋白。神经纤维蛋白抑制RAS信号传导通路,对细胞增殖起负调节作用。NF1基因缺陷患者缺乏正常功能的神经纤维蛋白,导致RAS通路不受控制的增殖,并形成一系列肿瘤综合征。目前,文献中报道了3 000余个NF1基因的不同致病突变位点[3]。

全基因组测序正越来越广泛地用于诊断Ⅰ型神经纤维瘤病,鉴于其在NF1基因缺陷临床诊断和预防中的价值,本文报道了一种通过这种方法鉴定的新移码变体,以填补基因库空白,有助于基因咨询及产前诊断,提高临床诊断率。

1 临床资料

1.1 临床数据收集

从先证者、先证者的父母、叔叔、姑姑、堂妹、祖父及其父母和兄弟姐妹采集了详细的病史,并对他们进行了标准的神经系统查体。先证者完善血尿便常规、肝肾功、电解质、风湿系列抗体、甲状腺功能化验及颅脑、颈髓、胸髓磁共振检查。先证者完善全基因组二代测序,先证者及其父母完成Sanger测序。此研究经山西医科大学第一医院伦理委员会批准[批号[2022]伦审字(S016)号],相关人员签署知情同意书。

1.2 全基因组测序和生物信息学分析

对DNA进行测序,以发现致病基因。使用基因组分析工具包(www.broadinstitute.org/gatk)筛选单核苷酸多态性。变异用ANNOVAR(ANNOVAR.openbiology.org/en/late/)注释。

1.3 Sanger测序和保守性分析

Sanger测序验证全基因组测序发现的候选致病基因,并在家系中进行共分离分析。引物由Primer Premier 5.0(Premier Biosoft,美国)设计,PCR在LifeECO Thermal Cycler TC-96/G/H(b)C(Bioer Technology,中国)上进行,以扩增覆盖突变位点的片段。PCR产物通过琼脂凝胶电泳进一步纯化,然后在ABI 3730XL DNA测序仪(Applied Biosystems,Thermo Fisher Scientific)上测序。Sanger测序结果通过Chromas Lite v2.01(Technelysium,Tewantin,Queensland,Australia)进行分析。

为评估突变位点的进化保守性,我们使用同源基因比对了不同动物物种的神经纤维蛋白序列。

1.4 变量建模

使用SWISS-MODEL(https://www.swissmodel.expasy.org)模拟野生型和突变蛋白的三维结构。随后,用PyMOL分析氨基酸变化对蛋白质分子结构的影响。

2 结 果

2.1 临床表现

先证者是一名9岁女孩,主因“发现牛奶咖啡斑9年”就诊。既往史无特殊。个人史系第一胎足月剖宫产,母亲孕期平顺,出生时一般状况良好,腋窝、腹股沟、胸部、腹部和背部有咖啡色斑点(图1),言语发育迟缓,多动、注意力不集中,学习成绩中下。神经系统专科查体:神志清楚,言语欠流利,理解力、计算力、定向力可,注意力差,查体合作。患者颅神经、肌力、肌张力、腱反射正常,病理反射阴性,感觉和共济查体正常。实验室检查:血常规嗜酸性血液粒细胞的绝对值为0.00×109/L,糖化血红蛋白为4.77%,甲状腺抗过氧化物酶抗体37.57 IU/mL,肝功能白蛋白39.4 g/L,肌酐40.7 μmol/L,尿酸465 μmol/L。尿常规、便常规、凝血系列和风湿系列抗体检验均未见异常。腰椎穿刺示脑脊液生化、常规无异常。颅脑、颈椎和胸椎磁共振平扫及加强成像、颅脑磁共振波谱和灌注加权成像均未见异常。本院裂隙灯检查未见Lisch结节。

图1 先证者Ⅳ-1全身多处牛奶咖啡斑

患者家系谱图如图2所示,世代由Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ表示。正方形代表男性,圆形代表女性。黑色代表表现出牛奶咖啡斑的家系成员。先证者Ⅳ-1由箭头指示。家系成员Ⅱ-2在儿童时期死于肺炎。NF1家系来自山西省。家系3代有5例患者。先证者(Ⅳ-1)的祖父、父亲、叔叔和堂妹都出现了类似的牛奶咖啡斑,未见神经纤维瘤及其他系统肿瘤、Lisch结节及特异性骨损伤。先证者母亲及其直系亲属未见牛奶咖啡斑。

图2 家族谱系图

2.2 全外显子组测序和生物信息学分析

本研究进行了全基因组测序和生物信息学分析,以准确定位该基因,并对先证者Ⅳ-1进行了全基因测序,靶区覆盖率大于99.80%,靶区平均深度为120.060X,靶区20X覆盖率大于99.50%。在外显子水平的样本中未发现与疾病相关的明显拷贝数变异。在先证者Ⅳ-1的NF1基因第38位外显子中发现了一个移码突变,c.5600delT(p.I1867Tfs*6)碱基缺失将神经纤维蛋白的1 867位氨基酸从异亮氨酸变为苏氨酸,并提前引入了一个终止密码子,将神经纤维蛋白从2 818个氨基酸截断为1 871个氨基酸。

2.3 Sanger测序确认

先证者和她的父亲表现出牛奶咖啡斑,他们的NF1基因中都有移码突变(c.5600delT chr17:29657367),母亲未表现出临床症状,也没有发现任何突变。在200名无关的汉族人对照中,没有发现任何突变。

2.4 变量建模

应用SWISS-MODEL模拟神经纤维蛋白,笔者从PDB数据库(http://www.rcsb.org)中选择了7PGT模型,这是相似度最高的模型,显示出与神经纤维蛋白74%的一致性,正常蛋白如图3A所示。此外,将神经纤维蛋白的第1 867位氨基酸从异亮氨酸变为苏氨酸,并用Chimera软件在第1871位截断该蛋白,然后使用SWISS-MODEL构建突变蛋白模型,如图3B所示。该模型显示神经纤维蛋白缺失947个氨基酸并失去其正常结构。

应用PyMOL,笔者在正常蛋白和突变蛋白中的第1 867位氨基酸寻找6Å范围内的氨基酸分子,并寻找原子之间的氢键。如图3C所示,正常蛋白质在异亮氨酸氨基酸周围有较多的氨基酸,形成11对氢键;如图3D所示,突变蛋白在苏氨酸氨基酸周围的氨基酸较少,并未发现氢键。笔者推测,p.I1867Tfs*6变体改变了氨基酸1867周围的分子间相互作用,并截断了947个氨基酸,这影响了神经纤维蛋白的构象和稳定性,从而影响了正常的生物学功能。

3 讨 论

本研究报道了1例与NF1相关的新型NF1基因移码突变(c.5600delT),该突变将神经纤维蛋白的第1 867位氨基酸从异亮氨酸转换为苏氨酸,并提前引入终止密码子,因此神经纤维蛋白从2 828个氨基酸被截断为1 871个氨基酸,并且经由GeneSplitter、NetGene2 和Human Splicing Finders预测,该突变影响神经纤维蛋白功能。

根据美国医学遗传学和基因组学学院指南[4],NF1基因中的突变c.5600delT(p.I1867Tfs*6)被鉴定为致病性变异,因为(1)ESP数据库、千人数据库、ExAC数据库中对照人群中未发现变异(PM2 中等);(2)非重复区框内插入/缺失或终止密码子丧失导致的蛋白质长度变化(PM4 中等);(3)突变与疾病在家系中共分离(在家系中多个患者中检测到此变异)(PP1 支持);(4)多种统计方法预测出突变会对基因或者基因产物造成有害影响,包括保守性预测、进化预测、剪接位点影响等(PP3 支持)。

目前NF1临床诊断仍基于1988年美国国立卫生研究院神经纤维瘤病共识发展会议制订的NF1诊断标准,并于2021修订[5]。无家族遗传史且符合两项或两项以上临床标准的患者被诊断为NF1;具有家族遗传史且符合一个或多个临床标准的患者被诊断为NF1。尽管此标准广泛用于NF1的临床诊断,但NF1存在一些非典型症状,并且一些症状与其他RAS相关疾病重叠。例如,如果只出现咖啡斑和雀斑,很大可能诊断NF1,但不能排除Legius综合征。因此,基因检测在NF1诊断方面具有决定性价值。

大约50%的NF1病例是家族遗传,其余病例由NF1基因突变引起。NF1基因的自发突变率高达1/10 000,是已知人类基因中突变率最高的基因之一。目前,文献中报道了超过3 000种NF1基因的不同致病突变。美国国家癌症研究所数据库(https://portal.gdc.cancer.gov/)显示,NF1基因导致神经纤维蛋白同义、剪接供体、错义、移码、停止增益、剪接受体、内含子、3′UTR和蛋白质改变变体的替代、缺失和插入突变。

真实世界的NF1基因研究表明,突变主要是点突变,如碱基替换、移码突变和小缺失。有学者分析NF1突变类型,截断变异比错义突变更常见,这种突变类型差异在19岁以下的患者中尤为明显[6]。此外,对30例NF1微缺失儿童和青少年的临床特征分析表明,患儿在很小的年纪就常表现出严重的临床症状。NF1基因微缺失患者体内肿瘤总负荷显著高于未缺失患者。此外,30例NF1微缺失儿童中有28例(93%)患有注意缺陷/多动障碍,有17例(56%)患有轻度至中度自闭症[7]。本研究患者表现出多个牛奶咖啡斑和注意力缺陷/多动障碍。

通过检索文献,总结了近10年的12篇移码突变的NF1病例报道[8-19],共31例患者,其中有8个家系。确诊患者的年龄从新生儿到65岁不等,有9例女性患者,男女比例为22∶9。最常见的症状是牛奶咖啡斑(94%),此外,22例患者(71%)患有神经纤维瘤,15例患者(48%)腋窝或腹股沟有雀斑。5例患者(16%)表现出Lisch结节,3例患者(14%)发生了明显的骨损伤。只有1例患者(3%)出现视神经胶质瘤。患者还表现为其他肿瘤,如纵隔神经纤维瘤、丛状神经纤维瘤,胃恶性肿瘤和多发性脑错构瘤以及轻度智力发育迟缓。所有病例均显示由移码突变引起的截断变异,这些变异发生在外显子5、24、25、28、29、32、37、39、42、43、46和54中。

NF1基因中的新的移码变体c.5600delT(p.I1867Tfs*6)将神经纤维蛋白第1 867位氨基酸从异亮氨酸转换为苏氨酸,并将其从2 818个氨基酸截断为1 871个氨基酸,从而使神经纤维蛋白缺失C末端结构域(CTD)和功能性核定位信号(NLS)。NLS由蛋白激酶A和蛋白激酶C磷酸化。CTD的丝氨酸2576、丝氨酸2578、丝氨酸2580和苏氨酸2556被蛋白激酶A磷酸化,与14-3-3蛋白结合,这降低了神经纤维蛋白的RAS-GAP功能。CTD被Ser 2808上的蛋白激酶C磷酸化,这对神经纤维蛋白核定位功能非常重要[20],NLS靶向非结构蛋白并引导神经纤维蛋白进入细胞核。笔者推测,致病性变体截断神经纤维蛋白的CTD和NLS,影响神经纤维蛋白核定位功能,然后影响其对RAS通路的抑制,导致临床症状。

本研究率先在NF1基因中鉴定出新的移码突变,c.5600delT(p.I1867Tfs*6),此突变将神经纤维蛋白的第1 867位氨基酸从异亮氨酸变为苏氨酸,并将其从2 818个氨基酸截断为1 871个氨基酸。本研究扩大了NF1基因突变库,为遗传咨询和产前诊断提供参考。然而,尚需要进一步的研究来更充分地阐明NF1基因型与表型的相关性。