胡黄连苷Ⅱ减轻阿霉素诱发H9C2心肌细胞损伤的潜在机制研究

陈泺帆,赵金丹,饶 红

(华中科技大学同济医学院附属梨园医院心血管临床医学中心,武汉 430077)

阿霉素(Doxorubicin,Dox)作为一种蒽环类药物化疗药物,是临床最常用的抗肿瘤药物之一,对淋巴瘤、乳腺癌、白血病、骨肉瘤等多种肿瘤疾病都有明显疗效[1]。然而,Dox具有的严重心脏毒性,使其临床应用方面受到较大限制。急性心脏毒性常导致心律失常、短暂性心功能障碍和心电图改变,这些改变通常可逆,也可表现为心肌损伤,最终进展为慢性或迟发性心脏毒性。慢性心脏毒性常导致心力衰竭、心功能下降和亚临床心肌功能下降。Dox引起的心肌毒性与剂量密切相关,最终可能导致进行性心力衰竭和不可逆心功能障碍[2]。过度的氧化应激、炎症反应、线粒体损伤、自噬、内质网应激、细胞焦亡等多种过程参与了Dox诱发的心脏毒性[3-4]。尽管研究人员对Dox引起心脏毒性的机制进行了广泛研究,但Dox导致心脏毒性的分子发病机制仍不完全清楚,尚缺乏有效的药物来预防Dox诱发的心肌损伤。因此,进一步探究Dox致心脏毒性的预防和治疗策略及潜在分子机制具有十分重要的意义。

沉默信息调节因子1(silen information reglator 1,SIRT1)是一种依赖于烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide,NAD+)的组蛋白去乙酰化酶,参与组蛋白的共价修饰,并可通过转录、翻译及翻译后修饰等途径参与多种疾病病理生理过程[5]。SIRT1在心肌缺血再灌注损伤[6]、心力衰竭[7]、心脏肥厚[8]等多种心血管疾病中发挥了保护作用。SIRT1通过参与多种信号通路(如SIRT1/PGC-1α、SIRT1/TGF-β、SIRT1/p53、SIRT1/NLRP3等)的调控进而减轻Dox诱发的心脏毒性,可能成为研发预防或治疗Dox诱发心脏毒性药物的有效靶点。胡黄连苷Ⅱ(Picroside Ⅱ,Pic)是胡黄连的主要活性成分之一[9],具有抗细胞凋亡、抗炎和抗氧化作用[10-11]。本研究探讨Pic通过调控SIRT1缓解Dox诱发的心脏毒性相关机制,为预防或治疗提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

Dox、Pic和SIRT1-IN-1(SIRT1选择性抑制剂)购于美国MCE公司;CCK-8试剂盒、TUNEL染色试剂盒、膜联蛋白V(Annexin V)-异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate isomer,FITC)细胞凋亡检测试剂盒、线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential,MMP)检测试剂盒(JC-1)和活性氧检测试剂盒购于上海碧云天生物科技有限公司;乳酸脱氢酶(LDH)检测试剂盒购于南京建成生物工程研究;兔抗GAPDH购于美国GeneTex公司,兔抗BAL-2、兔抗SIRT1购于英国Abcam公司,兔抗BAX、兔抗C-caspase-3购于美国Cell Signaling Technology公司;H9C2心肌细胞购于中国科学院细胞库。

1.2 方法

1.2.1细胞培养及处理

H9C2心肌细胞用含有10%胎牛血清和1%青链霉素的DMEM培养基维持培养在5% CO2的37 ℃培养箱,每2天更换新的培养基。当细胞汇合度达到80%～90%时用0.25%胰酶(含乙二胺四乙酸)消化传代。当细胞汇合度达到60%～70%时,将细胞分为对照组(Con组)、Dox组及不同浓度(5、10、20、40 μmol/L)的Pic治疗组(Dox+Pic组),Dox的干预浓度为1 μmol/L,Pic的最佳干预浓度则根据CCK-8检测结果决定。在进行药物干预前,用无血清培养基处理H9C2心肌细胞6 h,排除胎牛血清对细胞的促增殖作用,然后用Dox和Pic干预24 h进行后续实验。为研究Pic是否通过调节SIRT1来改善Dox诱发的H9C2心肌细胞损伤,给予Dox+Pic组SIRT1选择性抑制剂(SIRT1-IN-1,2 μmol/L)处理24 h(Dox+Pic+SIRT1-IN-1组)。

1.2.2CCK-8检测细胞活性及LDH水平检测

将H9C2心肌细胞以1×104个/mL的密度接种到96孔板培养,当细胞汇合度达到60%～70%时,Dox组细胞给与1 μmol/L Dox处理,Pic组给予不同浓度(5、10、20、40 μmol/L)Pic处理,Dox+Pic组给予1 μmol/L的Dox及不同浓度(5、10、20、40 μmol/L)Pic处理,Con组给予等量的二甲基亚砜(DMSO)处理。24 h后,每孔加入100 μL CCK-8工作液,并在37 ℃培养箱孵育90 min,最后用酶标仪在450 nm处读取每孔的吸光度值,以各处理组吸光度与对照组吸光度之比计算细胞的相对活力。收集各组经过干预的细胞培养液,采用试剂盒检测细胞培养液中的LDH水平。

1.2.3流式细胞术和TUNEL染色检测细胞凋亡

收集每组的细胞及细胞上清液,以300 r/min转速离心5 min,制备成单细胞悬液后用Annexin V-FITC和碘化丙啶(propidiumIodide,PI)进行染色,室温下避光孵育30 min,通过流式细胞仪检测细胞的凋亡指数。各组细胞制备细胞爬片,经药物干预后,用磷酸盐缓冲液(phosphate buffer saline,PBS)洗涤各组细胞2次,加入含0.3%Triton X-100的PBS,室温孵育5 min。根据TUNEL试剂盒说明书配制TUNEL检测液,每孔加入适量TUNEL检测液,37 ℃避光孵育60 min,孵育结束后PBS洗涤3次,用抗荧光淬灭剂封片后在荧光显微镜下观察。

1.2.4JC-1染色检测H9C2心肌细胞MMP改变

采用JC-1染色实验分析H9C2心肌细胞MMP的改变。按照JC-1试剂盒说明书配制JC-1工作液,进药物处理后的各组细胞中加入适量JC-1工作液,充分混匀,细胞培养箱中37℃孵育20 min;孵育结束后,吸除上清,用JC-1染色缓冲液(1×)洗涤2次,加入适量培养基,最后在荧光显微镜下观察记录。

1.2.5Western blot检测蛋白的表达

采用含有蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的RIPA裂解液提取各组细胞蛋白,通过BCA定量检测各组蛋白浓度,将提取的蛋白沸水浴10～15 min;十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate,SDS)-聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis,PAGE)分离蛋白,并用湿转法将电泳后的蛋白转至聚偏二氟乙烯(polyvinylidene difluoride,PVDF)膜。采用5%脱脂牛奶室温封闭2 h,TBST漂洗条带后在4 ℃过夜孵育一抗。一抗如下:兔抗GAPDH(1∶3 000)、兔抗BAX(1∶1 000)、兔抗BCL2、兔抗C-caspase-3(1∶1 000)、兔抗SIRT1(1∶1 000)。一抗过夜孵育后,采用TBST洗膜3次,每次5 min,辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔的二抗(1∶5 000)室温孵育2 h,TBST洗膜后用增强化学发光(enhanced chemiluminescence,ECL)化学显影液检测蛋白表达,ImageJ软件分析条带的灰度值。

1.3 统计学处理

2 结 果

2.1 Pic减轻Dox引起的H9C2心肌细胞损伤

Pic组中,只有高浓度组(40 μmol/L)的细胞活性减弱(P<0.05)。与Con组比较,Dox组细胞活性明显降低,Dox+Pic组除5 μmol/L亚组外,其他组的细胞活性均较Dox组升高;Dox+Pic组中40 μmol/L亚组的细胞活性较20 μmol/L亚组有所降低,表明Pic在一定浓度范围内能减轻Dox引起的细胞损伤,据此将20 μmol/L设定为后续实验中Pic的最佳干预浓度。Dox+Pic组LDH水平低于Dox组(P<0.05),见图1。

A:Pic化学结构式;B:Con组与不同浓度Pic组细胞活性比较;C:Con组、Dox组及不同浓度Dox+Pic组细胞活性比较;D:Con组、Dox组和Dox+Pic组细胞培养基中LDH水平比较;ns:P>0.05,与Con组比较;a:P<0.05,与Con组比较;b:P>0.05,与Dox组比较;c:P<0.05,与Dox组比较;d:P<0.05,与Con组比较。图1 Pic减轻H9C2心肌细胞损伤效果图

2.2 Pic有效抑制Dox诱发的H9C2心肌细胞凋亡和MMP降低

与Con组比较,Dox组的细胞凋亡率明显升高(P<0.05);与Dox组比较,Dox+Pic组的细胞凋亡率明显降低(P<0.05);JC-1染色结果显示,与Con组比较,Dox组细胞JC-1单体增加,同时JC-1聚合物减少,MMP降低,见图2～4。

A:流式细胞术检测各组细胞的凋亡率;B:流式结果统计分析图;a:P<0.05,与Con组比较;b:P<0.05,与Dox组比较。图2 流式细胞术检测结果

A:TUNEL染色检测细胞凋亡;B:TUNEL染色结果的统计分析;a:P<0.05,与Con组比较;b:P<0.05,与Dox组比较。图3 TUNEL染色结果

图4 JC-1染色结果

2.3 Pic改善Dox引起的细胞凋亡

Western blot结果显示,与Con组比较,Dox组细胞促凋亡蛋白BAX和C-caspase-3蛋白表达、BAX/BCL2比值升高,而抗凋亡蛋白BCL2蛋白表达降低,差异有统计学意义(P<0.05);与Dox组比较,Dox+Pic组BAX和C-caspase-3蛋白表达、BAX/BCL2比值降低,BCL2蛋白表达升高,差异有统计学意义(P<0.05),见图5。

A:Western blot检测各组细胞凋亡相关蛋白的表达情况;B:3组BAX蛋白表达情况;C:3组BCL2蛋白表达情况;D:3组BAX/BCL2比值;E:3组C-caspase-3蛋白表达情况;a:P<0.05,与Con组比较;b:P<0.05,与Dox组比较。图5 Pic改善Dox引起的细胞凋亡情况

2.4 Pic通过激活SIRT1改善Dox引起的细胞凋亡

SIRT1-IN-1可以明显地抑制H9C2心肌细胞SIRT1蛋白表达。Western blot结果显示,与Con组比较,Dox组SIRT1蛋白表达明显降低(P<0.05);与Dox组比较,Pic组SIRT1蛋白表达有所上升;与Dox+Pic组比较,Dox+Pic+SIRT1-IN-1组BAX和C-caspase-3蛋白表达增加,BCL2蛋白表达降低,BAX/BCL2比值升高,见图6。

3 讨 论

Dox是临床上广泛使用的蒽环类化疗药物,对多种肿瘤具有较好的治疗作用,但其具有剂量依赖性心脏毒性,可导致心肌病甚至心力衰竭,这也成为限制Dox临床应用的主要原因[12]。因此,更加深入全面地了解Dox导致心脏毒性的病理机制、研发Dox的替代药物或寻求改善Dox心脏毒性的方法仍是研究的当务之急。

Dox所致心肌损伤可分为两大类:收缩功能障碍和心肌细胞损失。虽然两者在该疾病进展过程中都非常重要,但心肌细胞损失可能在该疾病的进展中更为关键,因为它具有不可逆性,患者预后不良[13]。Dox导致心肌细胞凋亡是心肌细胞损失最为重要的原因之一。本研究发现,Dox导致心肌细胞损伤,表现为细胞活力明显降低,细胞培养液中的LDH水平明显上升;Annexin V-FITC/PI染色结果显示凋亡细胞增加,TUNEL阳性凋亡细胞也进一步证实了这一点。同时,Dox增加了促凋亡蛋白BAX、C-caspase-3的表达,抑制抗凋亡蛋白BCL2的表达,凋亡细胞的MMP会明显降低,间接证实Dox诱导细胞凋亡。

作为胡黄连的主要活性成分之一,Pic具有抗炎、抗氧化、抗凋亡等作用[14]。Pic可通过MEK-ERK1/2-COX2通路减轻脑缺血性损伤[15],抑制核因子κB改善脂多糖诱发的大鼠肺部炎症反应[16],抑制氧化信号通路保护血脑屏障[17],激活法尼酯X受体来保护胆汁淤积性肝损伤[9]。此外,Pic还可激活SIRT1减少炎症、氧化应激和细胞凋亡,进而减轻高同型半胱氨酸血症诱导的内皮损伤[11]。SIRT1是细胞内重要的去乙酰化酶,通过在肝脏、肌肉、脂肪、心脏等众多组织中对众多靶蛋白去乙酰化,在组织代谢中发挥关键作用[18]。证据表明,SIRT1可能在心血管疾病中发挥重要的保护作用,可介导多种通路来减轻炎症、氧化应激、线粒体损伤和细胞凋亡,进而缓解Dox诱发的心肌细胞损伤[19]。本研究结果显示,Dox能够明显降低H9C2心肌细胞中SIRT1蛋白表达,而Pic可以增加SIRT1蛋白表达。当使用SIRT1的选择性抑制剂后,Pic对H9C2心肌细胞的保护作用被逆转,证实Pic是通过增加SIRT1蛋白的表达间接发挥对H9C2心肌细胞的保护作用。

Dox所致心脏毒性的病理机制涉及氧化应激、炎症、细胞焦亡、自噬等多个病理过程。本研究初步通过体外细胞模型证实了Pic能有效地抑制Dox引起的细胞损伤,其潜在机制可能是Pic通过激活SIRT1来减轻Dox诱导的细胞凋亡,这为将来Pic临床应用于改善Dox所致心脏毒性提供了一定的理论依据。但是Pic能否影响Dox所致心脏毒性过程中的氧化应激、炎症等其他病理过程尚有待进一步探究。