鳜miR-25 的时空表达特征及其靶向核心生物钟基因的预测分析

周 仪，米 鍇，冯晓丽

（昆明医科大学基础医学院，云南 昆明 650500）

微小RNA（microRNA，miRNA）是一类长约22 个核苷酸的非编码RNA[1]，可通过加速mRNA 降解或抑制其翻译，进而抑制许多基因的表达，导致蛋白质水平降低[2]。miR-25 属于miR-106b-25 簇，其中还包括miR-93 和miR-106b。它在人类中定位于7 号染色体长臂（7q22.1）上的微染色体维持蛋白7（MCM7）基因的内含子上[3]。miR-25 在细胞增殖、分化、凋亡、氧化应激、炎症等生物过程起着非常重要的调控作用[4]。当前关于miR-25 的研究主要集中在癌症方面，其在胃癌、食管癌、乳腺癌等癌症组织中的表达要高于其他正常的组织，因此miR-25 也被认为是一种诱癌基因[5-7]。王博等[8]的研究发现miR-25 在鳜肌肉组织中有一定的表达量，但其在鳜中的时空表达特征以及作用机制还未明确，因此本研究对miR-25 在鳜组织和胚胎中的表达水平进行初步分析。

生物节律是生物为了能够适应以地球自转一圈（约为24 h）为规律的昼夜交替变化，而进化出了一种内在的调控机制。机体的各项功能活动都会受到生物节律的影响，其紊乱会导致肥胖、糖尿病等代谢类疾病的增加[9]。急性的昼夜节律紊乱还可能导致大脑炎症[10]。miRNAs 可与节律基因靶向结合从而参与生物节律的调控过程。有研究表明在小鼠中，miR-25-3p 能与节律基因Per的3’UTR 靶向结合，从而调节其震荡[11]。可见，miR-25 在节律调控方面也有着重要的作用。在饥饿条件下，miR-21、miR-125b 在鳜（Siniperca chuatsi）肌肉组织中均表现出昼夜节律性，并且可能通过调节生物节律参与饥饿胁迫下的动态调节过程[12-13]，因此miRNAs 对鱼类节律的调节具有重要的意义，但是其相关研究还较少，并且目前还未发现miR-25 在鳜节律方面的研究，因此本研究初步对miR-25 在鳜中的靶向核心生物钟基因进行预测分析。

鳜属于鲈形目、真鲈科、鳜属，具有非常高的营养价值，是一种名贵的淡水经济鱼类。Jeffrey 等[14]的研究表明肌肉的代谢和生长会直接受到生物钟的调节。正常的生物节律可以降低鳜炎症以及代谢类疾病的发生，并且促进肌肉的正常发育和生长。为了探究miR-25 在鳜的时空表达特征与其对生物节律基因的调控作用，该研究采用实时荧光定量PCR 技术，分析了鳜不同组织和胚胎中miR-25 的表达差异性，同时预测其靶向核心生物钟基因，用来初步揭示miR-25 对鳜生物钟的影响，并且为后续研究miR-25 的生理作用以及在生物节律方面的调节机制提供一些参考依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

RNA 提取（TRIzol）试剂、One Step PrimeScript®miRNA cDNA Synthesis Kit 试剂盒和SYBR Premix Ex TaqTMII 均购自宝日医生物技术有限公司。荧光定量PCR 仪购自美国伯乐公司（BioRad）。

1.2 样品来源

本次实验所用的鳜及胚胎均来自于湖南省水产科学研究所。

1.3 实验方法

1.3.1 鳜不同组织取样随机挑选健康、体重相近（约为200 g）的幼龄鳜3 尾，将其麻醉后置于冰上进行解剖，收集其脾、心、肠、肝、肾、白肌以及红肌组织，用液氮将组织迅速冷冻后置于-80 ℃冰箱中保存备用。

1.3.2 鳜不同时期胚胎取样鳜人工繁殖与胚胎孵化技术参照刘希良等[15]的方法。收集培养至2细胞、囊胚早、囊胚晚、原肠早、原肠晚、神经胚、视泡期、尾芽期、脑分化期、肌效期、心搏期以及出膜期的鳜胚胎各30 枚，分别保存于1 mL Trizol 溶液中，用液氮将其速冻后，置于-80 ℃冰箱中保存备用。

1.3.3 总RNA 提取使用Trizol 试剂（中国，宝日医生物技术有限公司）提取鳜组织和胚胎样品的总RNA，将提取出的RNA 进行琼脂糖凝胶电泳检测其质量，用核酸检测仪检测其浓度及纯度。

1.3.4 cDNA 合成cDNA 合成使用One Step PrimeScript® miRNA cDNA Synthesis Kit 试剂盒（中国，宝日医生物技术有限公司）。总反应体系为20 µL，具体操作过程及反应条件都按照试剂盒说明书进行。

1.3.5 引物设计及合成按照鳜miRNA 数据库[16]，使用 Primer 5.0 软件对miR-25 的荧光定量 PCR 引物进行设计，见表1，荧光定量内参基因为U6基因。引物合成由北京擎科生物科技有限公司完成。

表1 实时荧光定量PCR 引物Tab.1 The Primer Sequences for RT-qPCR

1.3.6 荧光定量PCR荧光定量PCR 反应体系包括cDNA 模板1 µL、SYBR Premix Ex TaqTMII（中国，宝日医生物有限公司）6 µL、上游引物0.5 µL、下游引物0.5 µL，无酶水补足总体系12.5 µL。反应程序参照朱鑫等[12]的方法。每个样品3 次重复。

1.3.7 靶向核心生物钟基因预测本实验采用的是TargetScan 预测软件对miR-25 在鳜中的靶向核心生物钟基因进行预测分析。TargetScan 能链接microRNA 相应靶基因的研究数据，并能提供靶基因3’UTR 的相关信息。在TargetScan（www.targetscan.org）中搜索获得可能与miR-25 靶向互补配对的靶基因，从这些靶基因中筛选出与生物钟调控有关的靶mRNA，再利用鳜基因组和转录组的数据库获得它们3’UTR 的序列，最后依照碱基之间的互补配对原则，查找这些靶mRNA 中是否有能够与miR-25 结合的靶点。

1.4 统计学处理

根据所得到的内参基因以及目的基因的Ct 值，采用2-∆∆Ct方法计算目的基因在不同样品中的表达[17]。使用SPSS 16.0 对实验数据进行单因素方差分析（One-Way ANOVA），再采用Duncan 检验对样本进行两两比较。分析结果表示为平均值±标准差（）。P<0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 miR-25 在鳜不同组织中的表达分析

采用RT-qPCR 技术检测miR-25 在鳜各组织中的相对表达水平。miR-25 在所检测的红肌、白肌、心等7 个样品组织中都有表达。在鳜红肌中的相对表达量最高，与其他组织相比，差异有统计学意义（P<0.05）；在心肌中次之（P<0.05）；在脾、肾、肠以及肝中的相对表达量较低，差异无统计学意义（P>0.05），见图1。

图1 miR-25 在鳜不同组织中的相对表达量Fig.1 Relative expression of miR-25 in different tissues of Siniperca chuatsi

2.2 miR-25 在鳜不同发育时期胚胎中的表达分析

使用RT-qPCR 检测miR-25 在处于12 个不同发育阶段的鳜胚胎中的表达特征。miR-25 在所检测的胚胎中均有表达，其在鳜胚胎的2 细胞期表达量最高，与其他时期胚胎相比，差异有统计学意义（P<0.05），并且随着胚胎发育的进行，其表达量逐渐降低，且在原肠早期后，除神经胚期外各时期胚胎间差异无统计学意义（P>0.05），见图2。

2.3 miR-25 靶向核心生物钟基因预测分析

利用与鳜成熟序列互补配对的反向互补序列中的种子序列，在鳜基因组和转录组数据库中寻找与miR-25 种子序列互补配对的靶基因序列。在数据库中找到miR-25 种子序列的第2-8 位碱基能够与节律基因Arntl2、Nr1d2bmRNA 的3’UTR 互补配对，见图3、图4。在TargetScan 数据库中搜索发现，在斑马鱼中与miR-25 有结合位点的靶基因有5 087 个，并且在斑马鱼中，节律基因Arntl2、Nr1d2bmRNA 同样有一段与miR-25 互补配对的碱基序列即靶点。由此推测在鳜和斑马鱼体内，miR-25 调控Arntl2、Nr1d2b的表达具有保守性，在鳜体内miR-25 可能通过对这2个核心生物钟基因的靶向调控来参与鳜生物节律的调控。

图3 miR-25 与Arntl2 结合靶位点预测Fig.3 The prediction of target site on target gene Arntl2 of miR-25

图4 miR-25 与Nr1d2b 结合靶位点预测Fig.4 The prediction of target site on target gene Nr1d2b of miR-25

3 讨论

组织内高表达的miRNA 往往发挥着重要的作用，本研究通过对miR-25 在鳜红肌、白肌、心、肝、脾、肾、肠中的表达进行研究，发现其在这些组织中均有表达，并且在红肌和心肌组织中呈高水平表达。Wang 等[18]研究表明，在斑马鱼中过表达的miR-25 可通过靶向FBXW7基因来促进心肌细胞的增殖，然而Li 等[19]研究表明，miR-25 在正常小鼠中过表达可通过靶点改变导致心肌细胞纤维化和凋亡。miR-25 在鳜心肌组织中的高水平表达，笔者推测miR-25 可能参与调控鳜心肌组织的生长、增殖或凋亡等生理过程，但其具体作用、功能及机制还需进一步研究。miR-25 在不同物种的心肌组织中可能发挥着不同的作用，但其对心肌组织产生的影响不可忽视，这凸显了miR-25 对治疗心脏相关疾病进一步研究的必要性。此外，在本研究中发现miR-25 在鳜红肌组织中表达水平较高，表明其在鳜红肌发育生长过程中同样发挥着非常重要的调控作用，但其目前关于miR-25 在鳜红肌中的功能及作用机理还未明确，有待进一步研究。

miRNA 的调控可以在胚胎发育过程中发挥重要作用。有研究表明，miR-449b 在绵羊精子中高表达，且能显著提高绵羊早期胚胎的发育率[20]。miR-430 能使斑马鱼早期胚胎发生期间的母体mRNA 去烯化和清除加速[21]。此外，在小鼠和人类卵母细胞中，miR-451 的下调会影响着床前胚胎的发生[22]。在鳜中发现，miR-21 在其胚胎2细胞时期的表达水平最高，表明其具有母源性，并在胚胎早期发挥抑制靶基因的功能[12]。本研究通过对miR-25 在鳜胚胎的不同发育时期进行表达水平的检测，发现miR-25 同样在鳜胚胎的2细胞期的表达水平最高，并且随着发育的进行，其表达水平不断降低，说明miR-25 具有母源性，这也表明了miR-25 在鳜胚胎中以母源性因子的形式发挥着重要的作用，但其具体的作用机制还未明确。

在生物的昼夜节律调控过程中，miRNAs 可与靶向生物钟基因结合而发挥重要作用。Park等[11]研究表明在小鼠中，miR-25-3p 在转录后水平调控时钟基因Per2振荡，参与昼夜节律的调控，并且可与miR-24-3p 协同作用来影响Per2的振荡。本研究通过碱基互补配对原则，在鳜基因组和转录组数据库中寻找与miR-25 种子序列互补配对的靶基因序列，结果表明节律基因Arntl2、Nr1d2bmRNA 的3’UTR 有miR-25 的靶点。此外，笔者通过TargetScan 数据库查找发现，在斑马鱼中节律基因Arntl2、Nr1d2bmRNA 同样有一段与miR-25 互补配对的碱基序列，这更加说明了在鳜中，miR-25 可能通过靶向结合Arntl2、Nr1d2b来参与其节律的调控，但miR-25 在鳜中的昼夜节律性以及调控机制仍需进一步研究。目前miR-25 在节律方面的研究极少，但从当前研究可看出，miR-25 在节律调控方面同样有着重要的意义，进一步研究其在生物节律方面的作用可能对减少许多健康风险的增加有着积极的作用。

本研究利用实时荧光定量PCR 的方法首次对miR-25 在鳜中的时空表达特性进行检测分析，并且对其靶向核心生物钟基因进行预测分析。结果表明，miR-25 在鳜不同组织以及不同发育阶段中的表达具有差异性，在鳜心肌、红肌以及胚胎发育早期可能具有重要的调控作用。通过靶基因预测分析，推测miR-25 可通过调控节律基因Arntl2、Nr1d2b的表达，从而参与鳜生长发育等生理过程的调节。本研究通过对miR-25 在鳜中的时空表达特征以及靶向核心生物钟基因进行初步研究，为后续研究其生理功能以及调控昼夜节律从而预防相关疾病提供参考依据。