美洲大蠊提取物对肝癌皮下移植瘤裸鼠自噬和侵袭转移的影响

张雪莎 ，周 杰 ，李彩琳 ，吴定宇 ，彭 芳

（1）大理大学药学院，云南 大理 671000;2）云南省昆虫生物医药研发重点实验室，云南 大理 671000）

肝癌是一种常见的恶性肿瘤，在全球范围内发病率和死亡率均较高。据统计，我国肝癌死亡率居于亚洲国家首位[1]。目前，临床上治疗肝癌的手段通常有手术治疗、肝癌消融治疗、外放射治疗和药物治疗等[2]，其中使用化疗药物治疗是一种较常规的治疗方式，但目前临床上使用的多数化疗药物易诱导肿瘤细胞产生耐药，甚至使肿瘤细胞具有多药耐药性（multi-drug resistance，MDR）[3]。因此探索药物对耐药肿瘤细胞的作用及机制成为治疗癌症的研究热点。

细胞自噬是一种依赖溶酶体的自我降解过程，有研究认为肿瘤细胞的自噬可促进癌症的生长和生存[4]。对于耐药肿瘤细胞，还可通过侵袭转移途径促进癌细胞的生存和扩散，这也是癌症难以治愈的一个原因。中药具有多靶点、多层次、低毒等优点，对肿瘤细胞及耐药肿瘤细胞疗效较佳。美洲大蠊作为一种动物中药，具有修复肝损伤、抗肿瘤等作用，尤其对肝癌具有较好的疗效，可逆转肝癌多药耐药。但美洲大蠊提取物对肝脏肿瘤细胞的自噬和侵袭转移的研究尚未见报道。故本文以裸鼠为实验对象，给予CII-3 和脱脂膏进行干预，并以索拉菲尼为阳性对照，探讨美洲大蠊提取物CII-3 与脱脂膏对肝癌细胞及肝癌耐药细胞自噬和侵袭转移力的影响。

开始采用适应性牵引，初始重量为头颅、双侧股骨髁上各2 kg，若患者无不适，牵引重量可逐日增加，一般为头颅、双侧股骨髁上每日各增加2 kg，最大重量可达体重的1/3～1/2，牵引过程中密切观察神经功能［6，7］。

1 材料与方法

1.1 实验动物

雌雄各半的标准体重的SPF 级Balb/c-nude裸鼠[动物合格证号：430727200101104518，许可证号：SCXK（湘）2019-0004]，由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供。本实验已经大理大学实验动物伦理委员会批准。

1.2 主要试剂和设备

美洲大蠊提取物脱脂膏，系褐色粘稠糕状，得率约为75.18%，批号为P14805-20171023，由美洲大蠊干燥虫体的醇提物制备的浸膏制得。美洲大蠊脱脂膏进一步纯化的粗提物CII-3 为黄褐色冻干粉末，得率约为0.2%，批号为17102125，以上2 种均由大理大学昆虫生物医药研究院张成桂博士提供；5-氟尿嘧啶（5-Pentafluorouracil，5-FU）（批号WXBC0190V），购自美国 Sigma 公司；索拉非尼（批号819C021），购自北京索莱宝科技有限公司；谷草转氨酶测试盒（AST）（批号20201112），谷丙转氨酶测试盒（ALT）（批号20201113），肌酐测试盒（CRE）（批号20201109），尿素氮测试盒（BUN）（批号20201120），均购自南京建成生物科技有限公司；全波长酶标仪由Bio-Teck 公司生产；激光共聚焦显微镜由徕卡公司生产；人肝细胞癌敏感细胞株BEL-7402，耐5-FU人肝细胞癌细胞株BEL-7402/5-FU，生产批号均为MXC050，均由上海美轩生物科技有限公司提供。

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1.3 移植瘤模型的建立[5]

取密度为8×107的BEL-7402 或BEL-7402/5-FU 细胞悬液，用100 µL 的 PBS 和 Matrigel 基质胶包裹好后，接种于裸鼠左前肢腋下。敏感组接种BEL-7402 为肝癌敏感细胞模型，其他组均接种BEL-7402/5-FU 为耐药肝癌细胞模型，接种第5 天开始，每2 d 1 次分别测量并记录裸鼠腋下肿瘤长短径。

采用SPSS 17.0 软件处理数据，正态分布的计量资料以均数±标准差（）表示，2 组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，单因素方差分析有意义后各组两两比较采用q检验。P<0.05 表示差异具有统计学意义。

1.4 动物分组、给药与取材[6]

随着人们对环保意识的增强以及国家政策的要求、移动破碎筛分设备在城市建筑垃圾、矿山等方面应用越来越广泛。

1.5 裸鼠生化指标检测[7]

按照试剂盒要求测定各组血清中AST、ALT、CR、BUN 等生化指标。

1.6 裸鼠的脏器指数和抑瘤率的检测[8]

将肝脏和肿瘤组织常规处理，分别进行石蜡包埋、切片、染色、封片，并于光学显微镜下观察病理组织变化。

作者是科学研究的主体，通过对发文作者及其合作网络的结构特征进行分析，可以反映该领域研究的核心作者群及合作关系。本文将获取的文献数据导入CiteSpace V中，选择网络节点(node types)为Author，以关键路径(pathfinder)算法，数据抽取对象为Top50，设置时间区间(time slicing)的值为1，生成了作者共引聚类知识图谱(如图3)。

1.7 肝脏和肿瘤组织病理学检测[10]

脏器指数=脏器重量（mg）/动物体重（g）。

1.8 肿瘤组织中自噬和侵袭转移相关mRNA 的检测[11]

CII-3 组心脏指数高于空白组、敏感组和耐药组（P<0.05）。与空白组、敏感组、耐药组相比，索拉菲尼组提升肝脏指数，CII-3 组和脱脂膏组则降低肝脏指数。各药物处理组均升高脾脏指数，尤其是CII-3 组。脱脂膏组心脏指数较索拉菲尼组高（P<0.05），其他组变化不明显。各组对肺脏指数影响，差异无统计学意义（P>0.05），见表3。

表1 自噬相关因子引物序列表Tab.1 Primers sequence of autophagy related factors

表2 侵袭转移相关因子引物序列表Tab.2 Primer sequence of invasion and metastasis related factors

1.9 统计学处理

梯度气象观测站是一个低层大气综合探测系统，集多层、多参量观测系统于一体，实现一定高度内的风温梯度信号参量的综合自动观测。气象数据为研究大气污染、大气边界层物理提供高质量的观测资料，同时提升公共气象服务能力、提高气象预报预测准确率也起着重要作用。

取未接种肿瘤细胞的裸鼠作为空白组；接种BEL-7402 并造模成功的裸鼠为敏感组；接种BEL-7402/5-FU 并造模成功的裸鼠随机分为30 mg/kg 索拉菲尼组、200 mg/kgCII-3 组和200 mg/kg 脱脂膏组，每组12 只。在接种后的第8 天分别按上述剂量给药（0.1 mL/10 g），连续给药14 d。末次给药24 h 后，各组眼眶静脉丛取血用于生化指标监测；剥取瘤块以及心、肝、肾、脾等重要脏器，用于脏器指数、肿瘤体积和抑瘤率的计算、肝脏和肿瘤组织病理学检测以及肿瘤组织相关指标的检测。

2 结果

2.1 CII-3 和脱脂膏对移植瘤裸鼠体重及肿瘤抑制的影响

前期各组裸鼠体重变化不大，CⅡ-3 组和脱脂膏组在后期有降低裸鼠体重的趋势，但差异无统计学意义（P>0.05）。敏感组瘤体积增长速度较快，耐药组趋于稳定。索拉菲尼组、CII-3 组和脱脂膏组在给药9 d 后瘤体积明显减小。敏感组瘤重显著高于其余4 组，耐药组明显高于索拉菲尼组、CII-3 组和脱脂膏组（P<0.01），索拉菲尼组、CII-3 组、脱脂膏组之间瘤重，差异无统计学意义（P>0.05），见图1。

图1 CII-3 和脱脂膏对皮下移植瘤裸鼠体重、肿瘤体积及瘤重的影响Fig.1 Effects of CII-3 and defatted ointment on body weight，tumor volume and tumor weight of nude mice with subcutaneously transplanted tumor

2.2 CII-3 和脱脂膏对移植瘤裸鼠脏器指数的影响

取肿瘤组织进行常规处理后，再按照相应试剂盒操作流程进行逆转录（RT-PCR）反应，确定自噬和侵袭转移相关因子引物，见表1，表2，观察RT-PCR 反应并计算各基因的相对表达量。计算公式：

表3 CII-3 和脱脂膏对皮下移植瘤裸鼠脏器指数的影响（，n=12）Tab.3 Effects of CII-3 and defatted ointment on organ index in nude mice with subcutaneously transplanted tumor（，n=12）

表3 CII-3 和脱脂膏对皮下移植瘤裸鼠脏器指数的影响（，n=12）Tab.3 Effects of CII-3 and defatted ointment on organ index in nude mice with subcutaneously transplanted tumor（，n=12）

与空白组比较，▲P <0.05，▲▲P <0.01；与敏感组比较，*P <0.05，**P <0.01；与耐药组比较，#P <0.05，##P <0.01；与索拉非尼组比较，△P <0.05，△△P <0.01。

2.3 CII-3 和脱脂膏对移植瘤裸鼠血清生化指标的影响

与空白组相比，敏感组裸鼠的AST 升高，索拉菲尼和脱脂膏组能降低AST，CII-3 组则升高AST。对ALT 的影响，也存在索拉菲尼和脱脂膏组降低其含量，CII-3 组则升高其含量。各给药处理组均提升CR 的含量，而各给药组对BUN 含量影响则不明显，见表4。

肿瘤体积=1/2（长径×短径×短径），肿瘤的相对体积=每次测量计算后的肿瘤体积/接种后第4 天的体积[9]。

表4 CII-3 和脱脂膏对皮下移植瘤裸鼠生化指标的影响（，n=12）Tab.4 Effects of CII-3 and defatted ointment on biochemical indexes of nude mice with subcutaneously transplanted tumor（，n=12）

表4 CII-3 和脱脂膏对皮下移植瘤裸鼠生化指标的影响（，n=12）Tab.4 Effects of CII-3 and defatted ointment on biochemical indexes of nude mice with subcutaneously transplanted tumor（，n=12）

与空白组比较，▲P <0.05，▲▲P <0.01；与敏感组比较，*P <0.05，**P <0.01；与耐药组比较，#P<0.05，##P <0.01；与索拉非尼组比较，△P <0.05，△△P <0.01。

2.4 CII-3 和脱脂膏对移植瘤裸鼠肝脏组织病理学的影响

空白组肝组织细胞排列整齐、形状规则，而敏感组和耐药组肝组织的细胞核排列不整齐且出现皱缩现象，索拉菲尼组、CⅡ-3 组和脱脂膏组对肝损伤的改善虽有一定作用，但效果不凸显，肝细胞排列部分仍存在不规则且多核现象，见图2。

2.5 CII-3 和脱脂膏对移植瘤裸鼠肿瘤组织病理学的影响

敏感组和耐药组肿瘤组织呈现鹅卵石或不规则形态，索拉菲尼组肿瘤组织细胞为片状坏死，细胞形态难以看清；CⅡ-3 组大部分细胞呈不规则形态，成片状坏死，细胞核出现缩小甚至碎裂；脱脂膏组肿瘤细胞坏死不明显，见图3。

近年来，浙江省金华市人大常委会探索开展财政专项支出第三方绩效评价工作，先后完成了保障性住房建设、科技创新支出等6个项目的第三方绩效评价，今年又开展了农村生活污水治理、居家养老服务机构补助等4个项目的第三方绩效评价，取得了良好效果。今年8月，该项工作获评“浙江人大工作与时俱进奖”提名奖。

图3 CII-3 和脱脂膏对移植瘤裸鼠肿瘤组织病理学的影响（HE 染色）Fig.3 Effects of CII-3 and defatted ointment on tumor histopathology in nude mice with transplanted tumor（HE staining）

2.6 CII-3 和脱脂膏对移植瘤裸鼠自噬相关因子mRNA 的影响

与敏感组相比，耐药组6 个自噬相关因子（ATG5、ATG7、BECLIN、LC3B、PIK3C3、P62）均呈现高表达。与耐药组相比，索拉菲尼组、CⅡ-3 组和脱脂膏组均能抑制上述6 个自噬相关因子的表达，见表5。

表5 CII-3 和脱脂膏对移植瘤裸鼠自噬相关因子mRNA 的影响（，n=12）Tab.5 Effects of CII-3 and defatted ointment on autophagy related factor mRNA in nude mice with transplanted tumor（，n=12）

与敏感组比较，*P <0.05，**P <0.01；与耐药组比较，#P <0.05，##P <0.01；与索拉非尼组比较，△P <0.05，△△P <0.01。

2.7 CII-3 和脱脂膏对移植瘤裸鼠侵袭转移相关因子mRNA 的影响

与敏感组相比，耐药组5 个侵袭转移相关因子（MMP2、MMP9、mTOR、AKT、4EBP1）均呈现高表达。与耐药组相比，索拉菲尼组除提升4EBP1 较为明显外，其余均降低；而CⅡ-3 组和脱脂膏组均能抑制5 个侵袭转移相关因子的表达，见表6。

2) 污染土中Pb赋存形态的改变是改性磷矿渣和普通硅酸盐水泥稳定土Pb变化的主要原因，普通硅酸盐水泥可促进Pb从弱酸提取态向可还原态转化，而改性磷矿渣可促进Pb从弱酸提取态向可氧化态转化.

表6 CII-3 和脱脂膏对移植瘤裸鼠侵袭转移相关因子mRNA 的影响（，n=12）Tab.6 Effects of CII-3 and defatted ointment on the mRNA of invasion and metastasis related factors in nude mice with transplanted tumor（，n=12）

表6 CII-3 和脱脂膏对移植瘤裸鼠侵袭转移相关因子mRNA 的影响（，n=12）Tab.6 Effects of CII-3 and defatted ointment on the mRNA of invasion and metastasis related factors in nude mice with transplanted tumor（，n=12）

与敏感组比较，*P <0.05，**P <0.01；与耐药组比较，#P <0.05，##P <0.01；与索拉非尼组比较，△P <0.05，△△P <0.01。

3 讨论

肝癌作为一种恶性肿瘤疾病，严重威胁着人民的身体健康和生命安全。化疗药由于毒性强，易产生MDR，疗效不显著等缺点限制了其在临床上的使用。多种中药因作用靶点多、不良反应小等优点被临床用于肿瘤的治疗[12]。美洲大蠊作为一种动物药，自开发为药物以来备受关注，已有大量研究表明美洲大蠊提取物可通过抑制肿瘤细胞生长、诱导细胞凋亡、逆转多药耐药等机制对多种癌症组织产生抑制作用[13]。细胞自噬和侵袭转移是肿瘤细胞的重要生命活动，许多中药发挥抗肿瘤作用就是通过调节肿瘤细胞的自噬、侵袭转移途径[14]。细胞自噬的调控对肝癌的作用至今仍是国内外的研究热点[15-16]，例如有研究报道了RNA 结合蛋白PNO1 和类固醇原件结合蛋白2SREP2 等就是通过调节肝癌细胞的自噬和侵袭转移从而抑制细胞凋亡成为肝细胞癌的治疗靶点[17-18]。此外，已有研究发现美洲大蠊提取物脱脂膏和CⅡ-3 有一定的对抗肿瘤MDR 的作用[19]，但对于CⅡ-3 和脱脂膏是否影响肿瘤的自噬和侵袭转移则没有深入研究。本研究通过动物实验检测美洲大蠊提取物对裸鼠瘤体积、脏器指数、生化指标，肿瘤细胞病理学及自噬和侵袭转移相关因子的表达来探讨脱脂膏和CⅡ-3 对肝癌耐5-氟尿嘧啶细胞（BEL-7 402/5-FU）自噬和侵袭转移能力的影响。

3.1 CⅡ-3 和脱脂膏的抑癌作用

本研究观察到CII-3 和脱脂膏有降低耐药肝癌裸鼠体重趋势，且可减少裸鼠皮下移植瘤体积和重量，表明美洲大蠊提取物CII-3 和脱脂膏可抑制耐药性肝癌细胞的生长。此外，本研究还在镜下观察到敏感组和耐药组肿瘤细胞呈鹅卵石或不规则形态，而索拉菲尼组和CII-3 组肿瘤细胞呈片状坏死，表明CII-3 与抗肝癌药物索拉菲尼均对肿瘤细胞有杀伤作用，这进一步证明了CII-3 具有抗肿瘤及抗肿瘤耐药效果。而脱脂膏组肿瘤细胞片状坏死情况不够明显，说明了美洲大蠊提取物CII-3 的抗肿瘤及抗肿瘤耐药的效果比脱脂膏更佳。先前的研究也证明了脱脂膏和CⅡ-3可逆转人肝癌细胞HepG2/ADM 细胞的多药耐药性，且CⅡ-3 的效果优于脱脂膏[20]。

3.2 CⅡ-3 和脱脂膏引起肝肾损伤

虽然先前大多研究认为美洲大蠊提取物可改善肝功能，减轻肝纤维化[21-22]，但本研究发现裸鼠接种肝癌敏感细胞和耐药细胞后会对肝脏组织产生一定影响，诱发肝损伤，且索拉菲尼、美洲大蠊提取物CII-3 均不能有效改善这种损伤。提示我们还应进一步加强对CII-3 在抗肿瘤方面的作用机制和安全性研究。此外该研究也发现了CII-3 和脱脂膏能提高脾脏指数，可升高血清CR 值，一定程度也说明了CII-3 和脱脂膏有一定的肝肾损伤，有必要进行进一步的分离纯化。

3.3 CII-3 和脱脂膏影响肝癌细胞的自噬和侵袭转移

近年来研究发现细胞自噬和侵袭转移与肝细胞癌的发生、转移及耐药等方面有密切的关系[23-24]。细胞自噬和侵袭转移过程是由许多基因共同参与完成，其中参与细胞自噬的基因主要包括ATG5、ATG7、P62。其中ATG5 主要参与自噬体形成，促进自噬前体膜延伸，ATG7 参与调控自噬体的形成，P62 主要依赖自噬进行降解。参与侵袭转移的主要有MMP 家族（MMP2 和MMP9表现最明显）、AKT、PI3K 等[25-26]。在研究各组自噬和侵袭转移相关因子的表达时发现，耐药肿瘤组织中P62、ATG5、ATG7、MMP2、MMP9、AKT 等均呈高表达，说明耐药肝癌细胞具有更强的自噬和侵袭转移能力，但P62 作为自噬负相关因子却呈现出高表达，可能是由于P62 作为自噬过程的最后阶段，受自噬影响较小。脱脂膏组和CII-3 组中除P62 外，其余自噬和侵袭转移相关因子的mRNA 均明显降低。表明CII-3 和脱脂膏可降低这种自噬和侵袭转移能力，且CII-3 的作用效果优于脱脂膏，但二者对不同的自噬和侵袭转移相关因子可产生不同程度的影响，其中对自噬相关因子ATG5 影响最为明显，而对ATG7 和P62 影响较小。证明美洲大蠊提取物可能只能作用于自噬的某些阶段。

综上所述，本研究从动物水平入手，在前期的实验基础上进一步研究了美洲大蠊提取物CII-3 和脱脂膏对肝癌耐5-氟尿嘧啶细胞（BEL-7402/5-FU）自噬和侵袭转移能力的影响，为该药的物质基础研究和临床应用提供了实验依据。但由于动物样本有限等问题，未能进一步监测肿瘤组织中相关蛋白的表达，还需要进一步的研究。