茯苓酸对大鼠心肌缺血再灌注损伤的影响机制研究

桑晶,李璐,姜洁,范伟

（1. 青岛大学附属青岛市中心医院/青岛市肿瘤医院急诊科，山东 青岛 266013；2. 青岛大学附属青岛市中心医院/青岛市肿瘤医院输血科，山东 青岛 266013；3. 青岛大学附属青岛市中心医院/青岛市肿瘤医院肝胆血管外科，山东 青岛 266013）

由于某种原因导致心脏缺血后，再对其进行灌注治疗恢复供血称为心肌缺血再灌注，此过程会对心肌组织造成不可逆转的损伤[1-2]。减轻心肌缺血再灌注损伤一直是临床研究的重点[3]。茯苓酸是从茯苓中提取的四环三萜类化合物，具有抗氧化、抗炎、降血糖等生物活性[4]。江桂萍[5]的研究表明，茯苓酸对缺血再灌注肾损伤具有修复作用。Pang等[6]研究表明，茯苓酸可通过激活PI3K/Akt信号通路减轻脑缺血再灌注引起的脑损伤。研究表明，Shh/Gli1信号通路在组织缺血性损伤修复过程中有关键作用，在角膜缺血、脑缺血、骨及骨骼肌缺血的动物模型中，Shh信号通路对缺血损伤发挥重要的修复作用[7]。Lang等[8]研究表明，通过激活Shh/Gli1信号通路可以降低缺氧/复氧心肌细胞的凋亡率。彭莉等[9]研究表明，异氟醚可激活Shh/Gli1信号通路，从而减轻大鼠脑缺血-再灌注引起的损伤。由此推测，Shh/Gli1信号通路在缺血再灌注损伤中发挥重要的修复作用。目前茯苓酸在心肌缺血再灌注损伤中的治疗效果尚未明确，因此，本研究就茯苓酸调节Shh/Gli1信号通路减轻心肌缺血再灌注损伤进行探讨，以期为临床用药提供参考。

1 材料与方法

1.1 主要材料与试剂

实验动物：SPF级180～200 g雄性SD大鼠60只，购自广东维通利华实验动物技术有限公司，生产许可证号：SCXK（粤）2022-0063。大鼠适应性饲养7 d，自由饮食和饮水，环境温度（22±2）℃，相对湿度（60±5）%，12 h光照/黑暗循环。

主要试剂与仪器：茯苓酸购自成都攀达生物科技有限公司；TRIzol试剂购自广州威佳科技有限公司；Shh/Gli1信号通路抑制剂环巴胺购自上海信帆生物科技有限公司；蛋白提取试剂盒购自武汉艾美捷科技有限公司；谷草转氨酶（aspartate aminotransferase,AST）、肌酸激酶（creatine kinase,CK）、心肌肌钙蛋白T（cardiac troponin T,cTnT）ELISA试剂盒购自江苏酶免实业有限公司；RT-PCR试剂盒购自上海西格生物科技有限公司；CX41显微镜购自上海信裕生物科技有限公司；RM2245病理切片机购自德国Lecia公司；总RNA提取试剂盒购自上海海方生物技术有限公司；Bax、Bcl-2、Shh、Gli1一抗及二抗均购自美国Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 分组与造模 将SD大鼠随机分为假手术组、模型组、茯苓酸低剂量组、茯苓酸中剂量组、茯苓酸高剂量组和茯苓酸高剂量+环巴胺组，每组10只。茯苓酸低剂量组、茯苓酸中剂量组、茯苓酸高剂量组于造模前3 d分别腹腔注射5、10、20 mg·kg-1·d-1茯苓酸[5]；茯苓酸高剂量+环巴胺组于造模前3 d腹腔注射20 mg·kg-1·d-1茯苓酸，再于缺血前30 min腹腔注射10 mg/kg Shh/Gli1信号通路抑制剂环巴胺[9]；假手术组和模型组腹腔注射等体积生理盐水。然后麻醉大鼠，进行造模，采用手术结扎大鼠冠状动脉左前降支，缺血30 min后拉松接线，再灌注供血120 min，假手术组穿线但不进行结扎。心电图ST段抬高后压低、部分心肌由紫色变为暗红色为造模成功[10]，本研究中57只造模成功。术后主动脉采血，各组选取3只大鼠的心脏组织进行TTC染色，测定梗死面积，取剩余7只大鼠心脏左心室组织进行其他检测。

1.2.2 测定心肌梗死面积 清洗心脏组织后置于-80 ℃冰箱冷冻，然后横切4～5片，用0.2 g/L的TTC染色，避光孵育后进行拍照，Image J软件分析梗死面积，并计算其百分比。梗死面积百分比=（梗死面积/左心室横面积）×100%。

1.2.3 ELISA法检测大鼠血清AST、CK、cTnT水平抽取大鼠主动脉血，离心后收集上清液，按照ELISA试剂盒说明书检测AST、CK、cTnT水平。

1.2.4 HE染色观察大鼠心肌组织病理学变化取大鼠部分左心室组织固定，石蜡包埋后切片，HE染色，显微镜下观察大鼠心肌组织形态变化。

1.2.5 TUNEL染色检测心肌细胞凋亡情况 取1.2.4中固定组织，石蜡包埋后切片，经脱蜡、乙醇梯度脱水后，按照TUNEL试剂盒说明书进行测定，荧光显微镜下观察细胞凋亡情况。

1.2.6 RT-PCR法检测心肌组织Shh、Gli1表达 取部分左心室组织剪碎，冰浴研磨匀浆，提取总RNA，将RNA逆转录为cDNA，荧光定量PCR扩增cDNA。以β-actin为内参，使用2-ΔΔCt法计算Shh和Gli1的相对表达量。Shh正向5'-GGAGTGAAACTGCGGGTGA-3'，反向5'-GCGGTACAGGAAAGTGAGG-3'；Gli1正向5'-TTCCT ACCAGAGTCCCAAGT-3'，反向5'-CCCTATGTGAAGC CCTATTT-3'；β-actin正向5'-CCTCTATGCCAACACAG TGC-3'，反向5'-GTCCTCCTGCTTGCTGATCC-3'。

1.2.7 Western blot检测大鼠左心室组织中Shh/Gli1信号通路相关蛋白表达 取1.2.6中组织匀浆液，提取组织总蛋白，BCA法检测组织蛋白含量，蛋白变性后进行SDS-PAGE电泳分离，然后转膜，置于封闭液中封闭，加入Bax（1∶1 500稀释）、Bcl-2（1∶1 500稀释）、Shh（1∶1 500稀释）、Gli1（1∶1 500稀释）一抗4 ℃摇床过夜，洗膜后分别加入相应二抗（1∶5 000稀释）常温下孵育2 h，再加入ECL发光液进行显影，最后用Image-Pro Plus软件进行蛋白定量分析。

1.3 统计学分析

数据采用SPSS 26.0软件进行统计学分析。实验结果以均数±标准差（）表示，多组间比较用单因素方差分析，两两比较采用SNK-q检验。P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 心肌梗死面积比较

假手术组心肌组织呈红色，无明显白色梗死区；模型组大鼠心肌组织出现大面积白色梗死区。与模型组比较，茯苓酸低剂量组、茯苓酸中剂量组、茯苓酸高剂量组梗死面积显著减小（P＜0.05），且随着浓度的增加梗死面积逐渐减小（P＜0.05）；相较于茯苓酸高剂量组，茯苓酸高剂量+环巴胺组梗死面积明显增大（P＜0.05），见图1。

图1 心肌细胞梗死情况

2.2 大鼠血清AST、CK、cTnT水平比较

与假手术组相比，模型组大鼠血清AST、CK、cTnT水平显著升高（P＜0.05）；与模型组相比，茯苓酸低剂量组大鼠血清AST、CK、cTnT水平无显著变化（P＞0.05），茯苓酸中剂量组、茯苓酸高剂量组大鼠血清AST、CK、cTnT水平显著降低（P＜0.05）；与茯苓酸高剂量组相比，茯苓酸高剂量+环巴胺组大鼠血清AST、CK、cTnT水平显著升高（P＜0.05），见图2。

图2 各组大鼠血清AST、CK、cTnT水平

2.3 大鼠心肌组织病理学变化情况

假手术组大鼠细胞排列整齐，形态结构完整，无明显损伤。模型组大鼠心肌细胞固缩，形态结构不规则，肌纤维紊乱，有较多炎症细胞浸润。与模型组相比，茯苓酸低剂量组、茯苓酸中剂量组、茯苓酸高剂量组心肌纤维排列稍整齐，炎症细胞浸润明显减少，且随着剂量增加，心肌损伤逐渐减轻。与茯苓酸高剂量组相比，茯苓酸高剂量+ 环巴胺组心肌纤维排列紊乱，炎症细胞浸润明显增加，见图3。

图3 各组织大鼠心肌组织病理学变化

2.4 各组大鼠心肌细胞凋亡比较

假手术组TUNEL染色阳性细胞少，凋亡率低。与假手术组相比，模型组TUNEL染色阳性细胞显著增加，细胞凋亡率显著升高（P＜0.05）；与模型组相比，茯苓酸低剂量组、茯苓酸中剂量组、茯苓酸高剂量组大鼠TUNEL染色阳性细胞显著减少，细胞凋亡率降低（P＜0.05），且呈剂量依赖性（P＜0.05）。与茯苓酸高剂量组相比，茯苓酸高剂量+环巴胺组TUNEL染色阳性细胞显著增加，细胞凋亡率显著升高（P＜0.05），见图4。

图4 心肌细胞凋亡情况

2.5 各组大鼠心肌组织Shh、Gli1表达比较

与假手术组相比，模型组大鼠心肌组织Shh、Gli1 mRNA表达显著降低（P＜0.05）；与模型组相比，茯苓酸低剂量组、茯苓酸中剂量组、茯苓酸高剂量组大鼠心肌组织Shh、Gli1 mRNA表达显著升高（P＜0.05），且呈浓度依赖性（P＜0.05）；与茯苓酸高剂量组相比，茯苓酸高剂量+环巴胺组大鼠心肌组织Shh、Gli1 mRNA表达显著降低（P＜0.05），见图5。

图5 各组大鼠心肌组织Shh、Gli1 mRNA表达情况

2.6 各组大鼠心肌组织Bax、Bcl-2、Shh、Gli1蛋白表达水平比较

与假手术组相比，模型组大鼠心肌组织Bcl-2、Shh、Gli1蛋白表达显著降低（P＜0.05），Bax表达显著升高（P＜0.05）；与模型组比较，茯苓酸低剂量组、茯苓酸中剂量组、茯苓酸高剂量组大鼠心肌组织Bcl-2、Shh、Gli1蛋白表达显著升高（P＜0.05），Bax蛋白表达显著降低（P＜0.05），且呈浓度依赖性（P＜0.05）；与茯苓酸高剂量组相比，茯苓酸高剂量+环巴胺组大鼠心肌组织Bcl-2、Shh、Gli1蛋白表达显著降低（P＜0.05），Bax蛋白表达显著升高（P＜0.05），见图6。

图6 各组大鼠心肌组织相关蛋白表达

3 讨论

急性心肌梗死是指冠状动脉急性阻塞，心脏肌肉因缺血坏死，使得心脏功能受损的急性病症[11]。随着生活习惯的改变，心肌梗死的发病率逐渐升高，且有年轻化的趋势[12]。缺血性心脏病和急性心肌梗死的治疗主要是再灌注治疗疏通血管，但再灌注会对心肌细胞造成二次损伤[13]。因此，如何减少再灌注损伤一直是临床研究的方向，也是急需解决的难题。本研究通过结扎再灌注建立心肌缺血再灌注损伤模型，结果显示，与假手术组相比，模型组大鼠心肌组织有大面积梗死区，心肌细胞固缩，形态结构不规则，肌纤维紊乱，有较多炎症细胞浸润；同时血清AST、CK、cTnT水平及TUNEL染色阳性细胞、细胞凋亡率、Bax表达显著升高，提示心肌缺血再灌注可导致心肌细胞损伤和凋亡。

茯苓酸是一种从茯苓中提取的天然活性物质，具有多种药理作用[14]。刘凤等[15]研究表明，茯苓酸通过激活Nrf2/HO-1信号通路，减轻OX-LDL诱导的人脐静脉内皮细胞氧化应激损伤。Jiang等[16]研究表明，茯苓酸可以通过激活Nrf2来发挥对缺血再灌注引起急性肾损伤的保护作用。本研究结果显示，与模型组相比，茯苓酸可以提高Bcl-2蛋白表达，降低心肌细胞凋亡率、Bax表达、血清AST、CK、cTnT水平，减少心肌梗死面积，提示茯苓酸可减轻心肌缺血再灌注引起的心肌损伤；HE染色结果显示，茯苓酸低、中、高剂量组心肌纤维排列稍整齐，炎症细胞浸润明显减少，损伤显著轻于模型组，提示茯苓酸可减轻大鼠心肌缺血再灌注损伤。

心肌缺血后的修复与多种信号通路有关。研究表明，Shh/Gli1信号通路是实现血管再生调控的通路之一[17]。伊忻等[18]研究表明，激活Shh信号通路可提高心肌血管生长因子的表达，促进心肌梗死大鼠的血管再生。余萍萍[19]的研究表明，白藜芦醇通过激活Shh信号通路，促进大鼠脑缺血性损伤后神经修复，改善神经功能。本研究结果显示，与假手术组相比，模型组大鼠Shh、Gli1表达显著降低，提示心肌缺血再灌注过程中Shh/Gli1信号通路被抑制；茯苓酸干预后，Shh表达显著升高，推测茯苓酸可能通过激活Shh/Gli1信号通路修复损伤的心肌细胞，降低细胞凋亡率；与茯苓酸单独处理相比，茯苓酸和环巴胺共同处理可降低Shh、Gli1表达，促进心肌细胞凋亡，增大心肌梗死面积，提示环巴胺可减弱茯苓酸对心肌细胞的修复作用，增加心肌细胞损伤。

综上，茯苓酸可通过激活Shh/Gli1信号通路减轻大鼠心肌缺血再灌注损伤。但中药治疗涉及的信号通路较多，本研究只对一种通路进行探究，后续还需进一步研究。