奇异海蟑螂提取物抗炎活性及改善筋伤的作用研究

韩 倩，蒋翠萍，李玥瑶，高程海，夏家朗，李 蜜，刘永宏，米顺利，易湘茜*

（1.广西中医药大学，广西 南宁 530200；2.广西海洋药物重点实验室，广西 南宁 530200）

1 实验材料

1.1 细胞与动物 RAW264.7 小鼠巨噬细胞由广西中药药效研究重点实验室惠赠。SD 大鼠72 只，健康雄性，体质量（180±20）g，由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供，生产许可证号为SCXK（湘）2019-0004，饲养温度为25～26 ℃，期间自由进食进水。

1.2 药物与试剂 奇异海蟑螂于2019 年7 月采集于广西钦州犀牛镇渔港，经广西中医药大学海洋药物研究院刘昕明副研究员鉴定为奇异海蟑螂科动物奇异海蟑螂（Ligia exotica）；水合氯醛（常州市海拓实验仪器有限公司，批号20170715）；硫化钠（天津市大茂化学试剂厂，批号20200813）；超氧化物歧化酶（SOD，货号RA20004）、丙二醛（MDA，货号RA20003）、白细胞介素-1β（IL-1β，货号RA20020）、前列腺素E2（PGE2，货号RA20013）试剂盒均由武汉贝茵莱生物科技有限公司提供；4%多聚甲醛（兰杰柯科技有限公司，批号20200815）；扶他林（中美天津史克制药有限公司，货号UN8R）；DMEM 高糖培养基（赛默飞世尔生物化学制品有限公司，批号8120493）；胎牛血清（苏州双洳生物科技有限公司，货号S711-001S）；一氧化氮（NO）试剂盒（南京建成生物工程研究所，货号A012-1-2）；脂多糖［LPS，西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司，货号L2880］；磷酸盐缓冲液（上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批号20201214）；胰蛋白酶（赛默飞世尔科技公司，批号20201216）；噻唑蓝（MTT，上海源叶生物科技有限公司，货号309E054）；二甲基亚砜（DMSO，北京索莱宝科技有限公司，货号D8370）；乙醇、乙酸乙酯、正丁醇（成都市科隆化学品有限公司，批号分别为20201019、20190812、20201031）。

1.3 仪器 全波长多功能酶标仪（美国PerkinElmer公司，型号EnVisonXcite）；高速冷冻离心机（南宁爱普仪器设备维修有限公司，型号Eppendorf 5810R）；分析天平（梅特勒-托利多仪器有限公司，型号ml2047）；高速低温组织研磨仪（武汉赛维尔生物科技有限公司，型号KZ-III-F）；生物安全柜（青岛海尔生物医疗股份有限公司，型号HR-1500-ⅡB2）；台式高速离心机［日立科学仪器（北京）有限公司，型号CT15E］；倒置显微镜（上海舜宇恒平科学仪器有限公司，型号ICX4I）；恒温水浴锅（常州金坛良友仪器有限公司，型号LVF6）；多功能全波长酶标仪（瑞士TECAN 公司，型号Infinate 2000pro）；立式恒温培养振荡器（上海智诚分析仪器公司，型号ZWYR-2102）；超净工作台（上海智诚分析仪器公司，型号ZHJH-1109C）；筋伤造模工具（自制）。

2 方 法

2.1 奇异海蟑螂提取物的制备 称取奇异海蟑螂样品2.5 kg，捣碎后用85%乙醇冷浸提取，重复3 次，每次冷浸7 d，将提取液合并、浓缩后得到奇异海蟑螂乙醇提取物289 g。取乙醇提取物适量，依次用乙酸乙酯、正丁醇萃取，浓缩萃取液后分别得到乙酸乙酯提取物10 g、正丁醇提取物60 g。

2.2 体外抗炎活性测定

2.2.1 药液的配置 取奇异海蟑螂乙醇提取物、乙酸乙酯提取物、正丁醇提取物各适量，分别加入适量生物级二甲基亚砜（DMSO），溶解后用DMEM 高糖培养基将上述药物稀释至浓度为100 μg/ml、200 μg/ml、400 μg/ml 的药液，于4 ℃密封保存，用于体外抗炎活性检测。

2.2.2 RAW264.7 细胞的培养 将预先置于-80 ℃中冻存的RAW264.7细胞解冻，并迅速转移至离心管，在1 000 r/min 下离心3 min，弃去上清液。用1% DMEM高糖培养基约5～10 ml 将细胞混合均匀，在37 ℃、5%CO2下培养至对数生长期，备用。

在最佳反应条件下：总反应时间为1.5 h，pH为3，间隔投加时间为20 min，采取1.5%，1.2%，0.9%的加药量进行多次重复实验，实验结果如图5所示。

2.2.3 细胞毒活性的测定（MTT 法） 取对数生长期的RAW264.7 细胞，调整细胞浓度为1×105个/ml，接种于96 孔板中，每孔100 μl，培养12 h 后弃去上清液，换入含药培养液100 μl，奇异海蟑螂乙醇提取物组（J 组）、奇异海蟑螂乙酸乙酯提取物组（E 组）、奇异海蟑螂正丁醇提取物组（B 组）分别设置3 个浓度（100 μg/ml、200 μg/ml、400 μg/ml），同时设置空白组作对照，继续培养24 h后弃去上清液，每孔加入5 mg/ml的MTT 20 μl。继续培养4 h 后弃去上清液，每孔加入DMSO溶液150 μl，震荡10 min后，在490 nm 波长下测定各孔的吸光值，计算细胞存活率。细胞存活率（%）=（给药组A490值/空白组A490值）×100%。

2.2.4 NO 含量测定 取对数生长期的RAW264.7 细胞，调整细胞浓度为1×105个/ml，并接种于96孔板中，每孔100 μl。培养12 h 后弃去上清液，加入经测试无细胞毒活性的药液100 μl，预处理1 h 后加入浓度为1 μg/ml 的LPS 继续培养24 h，诱导细胞炎症模型的建立。后吸取细胞上清液，使用试剂盒测定不同奇异海蟑螂提取物对LPS诱导细胞释放NO的含量。

2.3 体内改善筋伤效果评价

2.3.1 动物分组 大鼠适应性喂养7 d 后，按体质量随机分为9组：空白组、模型组、扶他林组、奇异海蟑螂乙醇提取物高剂量组（JH组）、奇异海蟑螂乙醇提取物低剂量组（JL 组）、奇异海蟑螂乙酸乙酯提取物高剂量组（EH 组）、奇异海蟑螂乙酸乙酯提取物低剂量组（EL组）、奇异海蟑螂正丁醇提取物高剂量组（BH 组）和奇异海蟑螂正丁醇提取物低剂量组（BL组），每组8只。

2.3.2 筋伤大鼠模型的建立与给药 参照文献［10］方法建立筋伤大鼠模型。用剃毛器脱去大鼠的右后肢腿毛，再用8%硫化钠脱去细毛，麻醉后将大鼠固定在自制击打器上，将200 g 砝码从塑料管（直径2 cm、高50 cm）顶部垂直自由落体冲击大鼠大腿外侧肌肉丰厚处，连续击打3 次，击打面积为2 cm2。当大鼠的右后肢肌肉出现肿胀，肌肉表面可见紫暗色，大鼠明显跛行，皮肤完整无破损且无骨折则视为成功建立筋伤大鼠模型。造模成功24 h 后开始给药，空白组与模型组分别每天涂抹生理盐水，扶他林组涂抹阳性药物扶他林（剂量为2 g/kg），其他给药组分别涂抹对应的奇异海蟑螂提取物，高剂量均为2 g/kg，低剂量均为1 g/kg。每天1次，连续给药5 d。

2.3.3 取材 给药5 d 后，禁食禁水12 h，将各组大鼠用10%水合氯醛（剂量为4 ml/kg）麻醉，腹主动脉取血5～10 ml 于肝素抗凝真空采血管中，用于检测血液中的纤维蛋白原含量、血浆黏度和全血黏液。随后以打击部位为中心，沿损伤处切取肌肉组织。用生理盐水冲洗干净，分装在冻存管中并标记，置于-80 ℃保存备用。

2.3.4 指标测定 使用试剂盒对血液进行全血黏度、血浆黏度、纤维蛋白原等血液流变学实验指标检测［11］。取肌肉组织用PBS 缓冲液（1∶9）制成匀浆，在4 ℃下3 500 r/min 低温离心20 min，收集上清液备用，检测损伤处组织的PGE2、IL-1β、MDA、SOD 等指标［12-13］，操作步骤严格按照试剂盒说明进行。此外，另一部分肌肉组织用于HE染色［14］，观察组织形态。

2.4 统计学分析 采用SPSS 21.0 统计学软件进行数据分析，符合正态分布的计量资料以均数±标准差（）表示，组间比较采用单因素方差分析。P＜0.05为有显著性差异。

3 结 果

3.1 奇异海蟑螂不同提取物的体外抗炎活性分析

3.1.1 奇异海蟑螂不同提取物对RAW264.7细胞存活率的影响 当浓度为200 μg/ml 和400 μg/ml 时，奇异海蟑螂乙醇提取物或乙酸乙酯提取物对RAW264.7细胞有不同程度的细胞毒性。当浓度为100 μg/ml 时，与空白组相比，奇异海蟑螂乙醇提取物、乙酸乙酯提取物和正丁醇提取物对RAW264.7细胞存活率无明显抑制作用（P＞0.05），由此可见，100 μg/ml 的奇异海蟑螂不同提取物均无明显的细胞毒性，均未对细胞生长活力造成影响，该药物浓度可用于后续实验，结果见表1。

表1 奇异海蟑螂提取物不同浓度对细胞存活率的影响（%，）

表1 奇异海蟑螂提取物不同浓度对细胞存活率的影响（%，）

注：与空白组比较，①P＜0.05

组 别空白组J组E组B组n6 6 6 6不同浓度的细胞存活率100 μg/ml 100.00±4.09 97.75±4.69 99.68±7.35 156.30±8.60 200 μg/ml 100.00±4.09 84.04±6.32①91.57±1.89 156.00±18.01 400 μg/ml 100.00±4.09 78.71±6.48①74.40±5.32①162.2±11.24

3.1.2 奇异海蟑螂不同提取物对LPS 诱导RAW264.7细胞释放NO 的影响 与空白组相比，经过LPS 诱导的模型组RAW264.7细胞，其释放NO的含量显著增加（P＜0.01）。相较于模型组，给予浓度为100 μg/ml的奇异海蟑螂乙醇提取物、奇异海蟑螂乙酸乙酯提取物和奇异海蟑螂正丁醇提取物均可显著降低RAW264.7细胞释放NO 的含量（P＜0.01），表明奇异海蟑螂乙醇、乙酸乙酯和正丁醇提取物均具有一定的体外抗炎活性，结果见表2。

表2 奇异海蟑螂不同提取物对RAW264.7细胞释放NO的影响（μmol/L，，n=6）

表2 奇异海蟑螂不同提取物对RAW264.7细胞释放NO的影响（μmol/L，，n=6）

注：与空白组比较，①P＜0.01；与模型组比较，②P＜0.01

images/BZ_65_275_1846_516_1940.pngNO含量空白组42.20±3.05模型组52.79±2.85①J组40.93±3.40②E组36.94±4.81②B组36.90±7.53②

3.2 奇异海蟑螂不同提取物体内改善筋伤模型大鼠效果评价

3.2.1 各组大鼠受损组织中MDA和SOD含量比较 与空白组相比，模型组大鼠肌肉组织中MDA 含量显著升高（P＜0.01），SOD 含量显著降低（P＜0.01）。相较于模型组，给予扶他林、奇异海蟑螂高剂量的乙醇提取物、乙酸乙酯提取物和正丁醇提取物均能显著降低组织中的MDA含量（P＜0.05或P＜0.01），同时显著增加肌肉组织中的SOD含量（P＜0.05或P＜0.01），结果见表3。

表3 各组大鼠受损组织中MDA和SOD含量比较（nmol/L，）

表3 各组大鼠受损组织中MDA和SOD含量比较（nmol/L，）

注：与空白组比较，①P＜0.01；与模型组比较，②P＜0.05，③P＜0.01

组 别空白组模型组扶他林组JH组JL组EH组EL组BH组BL组n8 8 8 8 8 8 8 8 8 MDA 912.99±9.35 1 344.40±58.71①1 178.69±51.62②1 121.45±37.94③1 224.66±58.35 1 177.78±50.61②1 283.01±28.41 1 165.55±28.80②1 334.97±80.30 SOD 675.17±23.83 585.62±39.38①646.89±25.66③672.57±36.59③601.11±22.95 654.46±17.55②613.95±34.78 676.93±26.93③609.38±33.51

3.2.2 各组大鼠受损组织中PGE2和1L-1β 含量比较 与空白组相比，模型组大鼠肌肉组织中PGE2和1L-1β 含量均显著升高（P＜0.01）。相较于模型组，给予扶他林、奇异海蟑螂高剂量的乙醇提取物、乙酸乙酯提取物和正丁醇提取物均能显著降低组织中的PGE2和1L-1β 含量（P＜0.05 或P＜0.01）。此外，低剂量的奇异海蟑螂乙酸乙酯提取物、正丁醇提取物也能分别降低组织中的PGE2和1L-1β 含量（P＜0.05 或P＜0.01），结果见表4。

表4 各组大鼠受损组织中PGE2和1L-1β含量比较（pg/ml，）

注：与空白组比较，①P＜0.01；与模型组比较，②P＜0.05，③P＜0.01

组 别空白组模型组扶他林组JH组JL组EH组EL组BH组BL组n8 8 8 8 8 8 8 8 8 PGE2 492.47±31.34 584.20±11.75①509.13±12.83③528.32±25.53③564.04±24.62 513.28±17.35③507.27±21.03③511.68±21.00③549.26±24.67 1L-1β 152.16±10.89 179.87±5.03①162.86±3.77③160.95±6.61②172.31±14.81 167.07±3.70②170.97±14.92 164.56±5.53②165.26±4.95②

3.2.3 各组大鼠血液流变学指标比较 与空白组对比，模型组大鼠的全血高切、中切、低切黏度，血浆黏度和纤维蛋白原含量均显著升高（P＜0.01）。与模型组比较，扶他林组和奇异海蟑螂不同提取物的高、低剂量组的全血低切黏度、血浆黏度和纤维蛋白原含量均显著降低（P＜0.05 或P＜0.01）；除奇异海蟑螂乙醇提取物低剂量组外，扶他林组和奇异海蟑螂不同提取物组的全血高切黏度和全血中切黏度亦显著降低（P＜0.05或P＜0.01），结果见表5。

表5 各组大鼠血液流变学指标比较（）

表5 各组大鼠血液流变学指标比较（）

注：与空白组比较，①P＜0.01；与模型组比较，②P＜0.05，③P＜0.01

组 别空白组模型组扶他林组JH组JL组EH组EL组BH组BL组n8 8 8 8 8 8 8 8 8全血高切黏度（mPa.s）4.84±0.23 5.46±0.60①4.91±0.16③4.96±0.25③5.14±0.32 4.96±0.13③4.91±0.20③4.86±0.18③4.98±0.26③全血中切黏度（mPa.s）6.93±0.36 7.64±0.32①7.05±0.28③7.28±0.30②7.57±0.32 6.99±0.24③7.31±0.17②7.13±0.44③7.13±0.09③全血低切黏度（mPa.s）33.45±1.63 37.90±0.73①34.20±1.14③34.13±1.01③34.74±1.27③35.00±1.39③35.19±0.86③34.99±0.98③36.53±0.96②血浆黏度（mPa.s）1.13±0.10 1.48±0.19①1.18±0.16③1.19±0.23③1.18±0.17③1.21±0.19③1.24±0.11②1.20±0.14③1.26±0.20②纤维蛋白原含量（g/L）2.39±0.29 3.01±0.34①2.46±0.34③2.50±0.26③2.51±0.34③2.54±0.35③2.64±0.30②2.53±0.33③2.58±0.24②

3.2.4 各组大鼠肌肉组织病理学形态 空白组大鼠肌肉组织形态正常，肌细胞和肌纤维排列整齐有序，无变性、无坏死、无充血、无炎性细胞浸润等。模型组肌纤维出现明显断裂，大量炎症细胞浸润，并出现大量充血现象等。与模型组对比，扶他林组的充血现象消失，无炎性细胞浸润，断裂的纤维间距缩短。奇异海蟑螂乙醇提取物高剂量（JH）组无炎性细胞浸润，新肌纤维开始生成；乙酸乙酯提取物高剂量（EH）组可见大量正常肌肉组织纤维，仅有较少炎性细胞；正丁醇提取物高剂量（BH）组无炎性细胞浸润，肌纤维有轻微的断裂。而奇异海蟑螂乙醇提取物、乙酸乙酯提取物、正丁醇提取物的低剂量组均仍有出血现象，结果表明高剂量的奇异海蟑螂乙醇提取物、乙酸乙酯提取物和正丁醇提取物对筋伤模型大鼠的肌肉组织均有不同程度的改善作用。结果见图1。

图1 各组大鼠肌肉组织病理切片（×40）

4 讨 论

筋伤通常会伴随着炎症反应的发生［15-16］，RAW264.7 巨噬细胞是机体内一种重要的炎症效应细胞，在诱导炎症反应发生的过程中起着关键作用［17］。LPS 是革兰氏阴性菌细胞壁的主要成分，能刺激RAW264.7 细胞释放炎症因子，引发炎症反应及导致炎症相关疾病的发生［18-19］。NO 是参与氧化应激反应的一种重要介质，广泛存在于各种生物体内，当生物体内NO 浓度过高时可导致局部组织损伤，从而加重炎症反应［20］。本研究通过LPS 诱导RAW264.7 巨噬细胞构建体外细胞炎症模型，结果显示，与模型组比较，奇异海蟑螂乙醇、乙酸乙酯、正丁醇提取物均能显著抑制NO 的生成，表现出显著的体外抗炎活性，为进一步指导奇异海蟑螂提取物治疗筋伤提供了药理依据。

采用重物自由落体击打组织造成损伤，其所致病理表现与临床筋伤相似，因而被广泛用于研究药物抗炎作用及药物对筋伤的治疗效果［21］。筋伤主要病理基础为创伤性无菌性炎症，会同时伴随着炎症细胞浸润、局部软组织损伤、肌纤维撕裂等症状，进而会导致诸多病理变化的出现，如氧化应激、局部炎症和组织修复等［22-23］，故本研究通过氧化应激、炎症因子、血液流变学及病理切片等多方面探究奇异海蟑螂提取物对筋伤模型大鼠的体内治疗效果。MDA 和SOD 是氧化应激反应的重要标志物，能直观地反映氧化应激程度。MDA 含量能够反映组织中的自由基含量和细胞损伤程度［24］，SOD活力可间接反映机体清除自由基的能力［25］。此外，当机体受到损伤会引起局部炎症反应，释放一系列炎症因子，PGE2和IL-1β 均为重要的炎症介质，是判断炎症是否得到缓解的重要指标［26-27］。本研究结果显示，相较于低剂量组，高剂量组的奇异海蟑螂乙醇提取物、乙酸乙酯提取物和正丁醇提取物能够更为显著地降低组织中的MDA 含量，增加组织中的SOD 含量，调节氧化应激水平，同时降低组织中的PGE2和1L-1β 的含量，缓解炎症反应，进而达到改善模型大鼠的筋伤效果。

“外治内应”是外敷药物治疗筋伤的疗效评价之一，血液流变学［28］及病理切片［29］能通过药物对血液微循环和损伤组织的改善作用，更为直观地证实药物治疗筋伤的效果。本研究结果显示，相较于低剂量，高剂量的奇异海蟑螂提取物均能更为显著地降低筋伤模型大鼠的全血（低/中/高切）黏度和纤维原蛋白含量，改善局部损伤组织的微循环，调节血液黏度。

综上所述，奇异海蟑螂提取物具有显著的体外抗炎活性，其中高剂量组的奇异海蟑螂提取物能更好地改善筋伤模型大鼠的治疗效果，其作用机制可能是通过增加SOD 含量和降低MDA 含量，改善组织的氧化应激反应，降低PGE2和1L-1β 含量，改善组织中的炎症因子，降低全血（高/中/低切）黏度、血浆黏度和纤维蛋白原含量，从而改善血液流变学等途径起效。