基于网络药理学预测γ-倒捻子素治疗肝癌的分子机制

李 玲，韦忠琼，周 梅，韦子琪，李铨香，吴玉珍，李晓龙，3*

（1.广西壮族自治区人民医院，广西 南宁 530021；2.广西医科大学，广西 南宁 530021；3.长寿与老年相关疾病教育部重点实验室，广西 南宁 530021）

肝癌是全球最常见的恶性肿瘤之一，也是癌症相关死亡的第三大原因，5 年生存率仅为18%［1］。寻找肝癌的有效治疗方法受到医学界的广泛关注，然而肝癌是一种多基因疾病，具有复杂的机理和信号途径，单一的治疗方式很难达到满意的治疗效果，且其发生过程缓慢，症状由轻变重，当患者察觉时已错过最佳手术治疗的时间，因此，使用靶向剂调节多种信号通路已成为肝癌治疗的研究热点［2］。

γ-倒捻子素（Mangosin），也称γ-山竹黄酮、γ-山酮，其含有氧杂蒽酮结构，具有抗癌、抗菌、抗氧化与抗炎等多种生物活性，在医学与食品领域的应用很普遍［3］。绝大部分γ-Mangosin 提取分离自藤黄科藤黄属植物山竹果壳内［4］。研究表明，山竹果壳中具有多种化学成分，如α-Mangosin、γ-Mangosin 等［5］，这些化学物质存在诸多疾病靶点，可有效用于抗菌、抗肿瘤、抗氧化与抗HIV［6-10］。此外，其果壳已被广泛用作抗过敏剂和抗炎剂［11］。在国内外的研究中，对于山竹果壳的成分分析提取与生物功能已开展了较深入的分析，然而其药理作用机制的研究较少。本研究基于网络药理学手段预测γ-Mangosin 治疗肝癌的多通路与多靶标的协同效应，及其治疗肝癌的可能机制。

1 方 法

1.1 γ-倒捻子素的鉴定 查阅文献获取γ-倒捻子素的化学结构式图片［5］，使用SwissADME数据库［12］绘制γ-倒捻子素的化学结构式，查看此物质的GI absorption 及Druglikeness 前5 项，分别为Muegge 、Lipinski、Egan、Veber 与Ghose。GI absorption 结果显示为High且Druglikeness 的前5 项中有2 项内容结果显示为Yes，表明可使用该药物活性成分进行研究［13］。

1.2 γ-倒捻子素靶标预测及作用靶基因筛选 经由STP 数据库（SwissTargetPrediction，http：//www.swisstarget prediction.ch/）［14-15］，绘制γ-Mangosin 的化学结构式，并对其靶基因进行搜索，同时向Uniprot 数据库（https：//www.uniprot.org/）内输入，通过限定物种为“human”，选择已经验证的基因，匹配出与靶基因对应的Gene Symbol（基因符号），以方便与肝癌对应靶基因的Gene Symbol 进行比对。未配对出的靶基因则剔除。

1.3 获取肝细胞癌相关疾病靶标 利用GeneCards数据库（https：//www.genecards.org/）［16］，输入“Liver Cancer”获取疾病作用靶点，并以Relevance score≥9.17为参考值，筛选后获取肝癌相关疾病的基因。

1.4 药物-疾病共同靶点的筛选 在Venny 2.1 在线软件作图工具平台（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）分别录入γ-倒捻子素与肝癌的靶点，绘制韦恩图，得到药物与疾病的共同靶点。

1.5 构建“药物-成分-靶点-疾病”网络 利用Cytoscape 3.8.0 软件［17］，导入γ-Mangosin 与LC 相关的核心靶点基因，由此完成“药物-共活性物质-核心靶点基因”关系网络的构建。

1.6 构建蛋白相互作用网络及筛选核心靶标 利用String 数据库平台（https：//string-db.org/）［18］预测蛋白相互作用关系。将γ-倒捻子治疗肝癌的潜在靶标导入String 数据库，限定物种为“human”，得到蛋白相互作用关系，再将其以TSV 格式保存下来［19］。利用Cytoscape 3.8.0 软件［17］，根据degree 值筛选γ-倒捻子素治疗肝癌的核心靶标。把提取自数据库String 的TSV 格式文件向Cytoscape 3.8.0 软件内导入，完成PPI网络的绘制，同时开展网络拓扑分析，基于Degree 值高低依次分布，利用Excel 软件制作核心靶标条形图，筛选出排名前5的靶标作为核心靶标［20］。

1.7 共同靶标通路与功能富集分析 把前文所明确的共同靶标向数据库Metascape（https：//metascape.org/gp/index.html#/main/step1）内导入，开展基因本体论（GO）、京都基因与基因组百科全书（KEGG）两项富集分析，搜集P＜0.05、最小计数是3 同时富集因子（EFs）在1.5 以上（EFs 即观察所得计数同偶然预期计数之比）的项，同时经由微生信网站（http：//www.bioinformatics.com.cn/plot_basic_gopathway_enrichment_bubbleplot_081）绘制富集分析图。

1.8 分子对接方法 使用分子对接技术研究γ-倒捻子素与关键靶点之间的相互作用，即分别自PubChem数据库（有机小分子生物活性数据库，https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）下载γ-倒捻子素关键成分的3D结构，通过蛋白质结构PDB数据库（http：//www.rcsb.org/）进行基因靶蛋白结构的下载，再运用AutoDock将γ-倒捻子素分别对接至蛋白交互网络Degree 值排名前5 的核心靶标的活性口袋，AutoDock 可自动识别蛋白潜在结合位点，计算中心和大小后自定义对接口袋大小。对接后，借助软件AutoDockVina对所得复合物进行评分，评分愈小，说明受体亲和配体能力愈强。完成上述操作后，使用R语言的pheatmap 包绘制热图。

2 结 果

2.1 γ-倒捻子素鉴定及其靶标筛选结果 由STP 数据库获得100 个γ-Mangosin 相关靶基因，这些靶点名称经由Uniprot 数据库转变成相应的基因名，同时对非人类、重复靶点作剔除处理，最后得到潜在靶点100个。γ-Mangosin化学结构式见图1。

图1 γ-倒捻子素化学结构式

2.2 肝细胞癌作用靶点筛选结果 通过GeneCards数据库以“Liver Cancer”为关键词进行检索，获得与肝细胞癌相关的靶点共16 730 个。将“Relevance score≥9.17”设成参考值，筛选后获得与肝细胞癌相关的靶点共2 092个。

2.3 药物-疾病共同靶点筛选结果 将γ-倒捻子素对应基因及肝细胞癌靶基因相匹配，得到66个交集靶标，维恩图如图2所示。

图2 药物-疾病共同靶点维恩图

2.4 “药物成分-靶点-疾病”网络构建与分析 向软件Cytoscape内导入γ-Mangosin和LC相关的核心靶点基因，完成“药物成分-靶点-疾病”网络的构建，如图3所示。γ-倒捻子素的主要作用靶点有66个，具体靶标如下：CYP19A1、IDH1、PTGS1、PTGS2、FASN、ALOX12、NFKB1、RELA、PLK1、HSP90B1、F10、CTNNB1、HSP90AA1、NOS2、HSP90AB1、MELK、PRKCI、TNF、PIM1、SIRT1、AGTR1、CHEK2、CHEK1、MTOR、PIK3CA、IKBKB、CXCR2、IGF1R、AURKB、KDR、MET、ERBB2、KLK2、AKT1、PLAU、FBP1、CALCA、CCR5、ALK、PRKCB、PRKCE、PLG、PRSS1、CDK4、CA9、PRKCD、PRKCA、CDK2、CHUK、EP300、RPS6KA3、SRD5A1、ERN1、ABL1、CSF1R、PDGFRB、PDGFRA、RET、MAPK3、CASP1、DHFR、AXL、RARA、RYR1、FLT4、TEK。

图3 “药物成分-靶点-疾病”网络图

2.5 PPI网络及核心靶标 向String 数据库内导入γ-Mangosin 治疗LC 的潜在靶标，将“human”作为限定物种，获得PPI 图（见图4）。对无互作蛋白（单独游离蛋白）做排除处理，圆圈（节点）的颜色与大小反映出Degree值高低，圆圈面积越大，Degree值越大，其颜色从红转蓝对应的Degree 值越大。边的粗细反映出Combine score值高低，边越粗，提示Combine score值越大［19］。

图4 蛋白相互作用网络1（PPI 1）

再将由String 数据库得到的蛋白相互作用关系图以TSV 格式保存后导入Cytoscape 3.8.0 软件绘制PPI网络（见图5）。其中，橘色圆形节点表示潜在靶标，连线表示不同靶标间的联系。经由Network Analyzer 实施网络拓扑分析，再基于Degree 值对节点颜色程度作调节，颜色越深，提示此靶标和其它靶标间的关联性越显著，最终得到PPI网络。把Degree值为14及以上的节点，利用Excel 软件制作出前30 个关键蛋白质节点条形图（如图6所示）。其中，Degree值排名前5的核心靶标为MTOR、MAPK3、AKT1、HSP90AA1、TNF［20］。

图6 中药-疾病核心靶标条形图

2.6 GO 功能富集分析结果 针对以上潜在靶点基因，经由GO 功能富集分析发现，-log10（pvalue）值排名前20条的通路为蛋白激酶活性、转移酶活性的正调控、细胞迁移的正调控、细胞对氮化合物的反应、细胞对脂质的反应、氧化应激反应、蛋白激酶B 信号、脂质代谢过程的调节、老化、氧气含量反应、激酶结合、细胞对生长因子刺激的反应、细胞对有机环状化合物的反应、伤口愈合、对外部刺激反应的正向调节、组蛋白磷酸化、对血管内皮生长因子刺激的细胞反应、趋向性、细胞粘附的调节、对肿瘤坏死因子的反应。如图7所示。

图7 GO功能富集分析图

2.7 KEGG 通路富集分析 对以上潜在靶点基因，经由KEGG 通路富集分析发现，-log10（pvalue）值排名前20 条的通路为癌症通路、EGFR 酪氨酸激酶抑制剂耐药、糖尿病并发症中的AGE-RAG 信号通路、癌症中的微小RNA、FoxO 信号通路、雌激素信号通路、病毒致癌作用、VEGF 信号通路、Apelin 信号通路、内吞作用、钙信号通路、粘附连接、癌症中的转录失调、血清素突触、胰高血糖素信号通路、卵巢类固醇生成、膀胱癌、致病性大肠杆菌感染、补体和凝血级联、TGF-β 信号通路。见图8。

图8 γ-倒捻子素潜在靶标的KEGG通路富集分析

2.8 分子对接结果 根据Vina 得分数据绘制热图，见图9。分子对接结果显示，γ-倒捻子素与MTOR、MAPK3、AKT1、HSP90AA1、TNF 等5 个关键靶点对接共产生45 对结合复合物，其中对接的Vina 分值≤-7.0 的有27 对，表明大部分关键靶点与γ-倒捻子素的结合能力较强，而TNF 基因的6q00 与γ-倒捻子素相互作用的Vina 分值（即结合能）最佳，是-9.10 kcal/mol。

图9 Vina得分图

3 讨 论

本研究通过网络药理学方法预测出γ-倒捻子素治疗肝癌的潜在作用靶点和作用机制。经由数据库GeneCards 确定了2 092 个与肝细胞癌有关的靶点，药物靶点同疾病靶点两者的交集靶标合计66 个。通过PPI 网络分析筛选出Degree 值排名前5 的核心靶标为MTOR、MAPK3、AKT1、HSP90AA1、TNF。

由分子对接结果可知，药物与靶点具有一定的结合性，药物与MAPK3、TNF 靶点的亲和力较高，预测γ-Mangosin 有助于LC 的治疗。TNF 具有多重特点和多重功能，一方面TNF 可特异性地杀伤肿瘤细胞且不伤害体内正常细胞；另一方面TNF 参与免疫反应并诱导炎症反应的发生。在重型肝炎中，TNF 具有双重作用，一方面促进正常肝组织再生，另一方面可增强TNF 介导的被病毒感染细胞的溶解作用。吴玮等［21］研究发现，TNF-α 单抗作用后，HepG2 细胞表达的NF-κB核蛋白大幅下调，HepG2 细胞的凋亡率大幅提高，两者的剂量与时间依赖性表现明显，所以TNF-α介导的信号途径NF-κB 同LC 的形成、进行、迁移与耐药有着紧密联系。在介导细胞反应方面，MAPK 作为信号系统起着关键作用，表达于所有的真核细胞中。研究表明，信号途径MAPK 可磷酸化NF-κB（核转录因子）、酶类与细胞骨架蛋白等，由此参与调控细胞分化、增殖、转化与凋亡，同时和肿瘤、炎症等诸多疾病的出现存在紧密联系［22］。张芬等［23］研究发现，MAPK1/MAPK3 的活化可促进乳头状甲状腺癌（PTC）的上皮间质转化（EMT）。邓志华等［24］研究发现，肝癌组织中p38 MAPK 蛋白表达水平升高，可作为肿瘤启动子起作用。因此MAPK 介导的信号通路可能与肝癌的发生有关。

KEGG 富集分析表明，γ-倒捻子素治疗肝癌主要通过FoxO、VEGF 等信号通路发挥作用。对于诸多生理与病理活动，信号途径FoxO 起着重要作用，在哺乳动物内已检出以下4个亚科：FoxoO1、3、4、6，目前已有越来越多的实验证据表明FoxO 信号通路可能在癌症中发挥肿瘤抑制的作用［25］。另外，Gong 等［26］通过使用综合生物信息学分析确定，MAPK8/FoxO 信号通路对癌症和脂肪肝的发展具有重要意义，并可以证实TAM 可以通过MAPK8/FoxO 信号通路在乳腺癌细胞（MCF-7、T47D、ZR-75 和MDA-MB-231）和肝细胞（LO2）中发挥作用。孙岩岩等［27］研究发现，丹参酮可通过抑制VEGF/VEGFR 信号通路，阻滞LC 细胞分裂，使其停滞于G0/G1 期，从而抑制肝癌的增殖，表明VEGF信号通路在肝癌发生、恶化中发挥作用。

综上所述，本研究以网络药理学为基础，对γ-Mangosini 治疗肝癌的核心靶点与核心信号途径加以预测，建立“药物成分-靶点-通路”的生物网络和蛋白质交互作用网络，从而在理论上为γ-Mangosin 治疗肝癌提供参考，但其治疗肝癌的作用机制仍需开展进一步的体内和体外实验来验证。