海州湾海域野生甲壳动物病原携带调查

孙苗苗，陆波，伏光辉，叶仁智，卢璐，路吉坤

（连云港市海洋与渔业发展促进中心，江苏 连云港 22200）

甲壳动物是渔业资源的重要组成部分，种类繁多，数量庞大。其中，多数甲壳动物物种是许多海洋经济动物的重要饵料来源，也是海洋生态系统中能量流动、物质传递的重要载体，在海洋生态系统的生态过程中发挥着重要作用[1]。

白斑综合征病毒（White Spot Syndrome Virus,WSSV）、传染性皮下及造血组织坏死病毒（Infec tious Hypodermal and Hematopoietic Necrosis Virus,IHHNV）、虾肝肠胞虫（Enterocytozoon hepatopenaei,EHP）、十足目虹彩病毒（Decapod iridescent virus 1,DIV1）及对虾急性肝胰腺坏死病（Acute hepatopan creatic necrosis disease, AHPND），是水生动物二类及三类疫病病原[2]。目前，关于养殖的甲壳动物病原研究报道较多。张家松等[3]开展了广东沿海地区不同养殖模式下凡纳滨对虾携带WSSV 和IHHNV的调查。范东东等[4]调查了华东、华南主要养殖区罗氏沼虾IHHNV 的流行情况，发现IHHNV 广泛流行, 阳性率高达90%，但所有成年罗氏沼虾均未表现出明显的病症，仅为病毒的携带。薛晖等[5]开展了淡水养殖甲壳动物WSSV 流行病调查，发现中华绒螯蟹、克氏原螯虾、日本沼虾均感染WSSV。杨丽诗等[6]开展了3种来源野生斑节对虾携带病毒情况调查，揭示3种来源的斑节对虾亲虾普遍携带WSSV 和IHHNV。刘苏等[7]对大亚湾海域的野生对虾，进行早期死亡综合征病菌和白斑综合征病毒检测，发现早期死亡综合征病菌携带率，总体处于较高水平。

近年来，我国沿海海湾面临着日趋严重的环境污染压力，水生动物疫病频发。现于2022 年11 月，对海州湾海域野生甲壳动物携带病原情况进行调查，拟为水生动物流行病防治提供科学依据。

1 调查方法

1.1 材料

2022 年11 月，在海州湾海域收集捕捞甲壳动物样品44 个，其中鹰爪虾（Trachypenaeus curvirostris）7 个、日本蟳（Charybdis japonica）3 个、三疣梭子蟹（Charybdis japonica）3 个、口虾蛄（Oratosquilla oratoria）31 个。取每个样品的肝胰腺置于装有无水乙醇的样品管中，-20 ℃保存备用。

1.2 检测方法

提取样品DNA，采用生工生物工程（上海）股份有限公司的动物组织基因组DNA 提取试剂盒。 白斑综合征病毒、传染性皮下及造血组织坏死病毒、虾肝肠胞虫、十足目虹彩病毒及对虾急性肝胰腺坏死病通用引物见表1。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

表1 5种病原的引物序列

PCR 扩增以病原的目的基因的载体质粒作为阳性对照，以双蒸水作为空白对照。PCR 反应试剂采用生工生物工程（上海）股份有限公司的2×Taq PCR Mastermix 试剂盒。WSSV 检测参照文献[8]，IHHNV 检测参照文献[9]，EHP 检测参照文献[10]，DIV1 检测参照文献[11]，AHPND 检测参照文献[12]。

反应结束后，以0.5 mg/L 的4S GelRed 核酸染料显带，在1.5% 琼脂糖凝胶中电泳检测PCR 产物，并用凝胶成像系统观察结果并拍照。阳性产物，送至生工生物工程（上海）股份有限公司测序。利用NCBI 网站的Blast 工具对测序结果进行相似性比对分析。

2 结果与分析

2.1 样品DNA

样品DNA 提取结果见图1。由图1 可见，样品条带明显，样品DNA 质量较好。

图1 DNA 样品琼脂糖电泳结果

2.2 白斑综合征检测

白斑综合征PCR 扩增检测结果见图2（a）（b），海州湾海域野生甲壳动物WSSV 检测结果见表2。由图2 可见，阳性样品在1 447 bp 和941 bp 处均有条带，阴性样品则无此条带。由表2 可见，鹰爪虾、口虾蛄阳性样品各1 个；第1 次PCR，仅鹰爪虾检出阳性样品1 个，第2 次PCR 口虾蛄检测出阳性样品1 个，阳性率分别为14.29%、3.23%，日本蟳和三疣梭子蟹未检出。

图2 WSSV PCR 扩增结果

表2 海州湾海域野生甲壳动物WSSV 检测结果

2.3 传染性皮下及造血组织坏死病检测

传染性皮下及造血组织坏死病PCR 扩增检测结果见图3，海州湾海域野生甲壳动物IHHNV 检测结果见表3。由图3 可见，阳性样品在389 bp 处有条带，阴性样品则无此条带。由表3 可见，鹰爪虾阳性样品2 个，其中1 个样品条带较弱，阳性率分别为28.57%；日本蟳、三疣梭子蟹、口虾蛄未检出阳性。

图3 IHHNV PCR 扩增结果

表3 海州湾海域野生甲壳动物IHHNV 检测结果

2.4 虾肝肠胞虫检测

虾肝肠胞虫PCR 扩增检测结果见图4（a）（b），海州湾海域野生甲壳动物EHP 检测结果见表4。由图4 可见，第1 次PCR 所有样品均未扩增出阳性条带；第2 次PCR，在147 bp 处扩增出条带。由表4可见，鹰爪虾阳性样品2 个，阳性率分别为28.357%；口虾蛄检出阳性样品1 个，阳性率为3.23%；日本蟳、三疣梭子蟹未检出阳性。

表4 海州湾海域野生甲壳动物EHP 检测结果

2.5 虹彩病毒检测

虹彩病毒PCR 扩增检测结果见图5（a）（b），海州湾海域野生甲壳动物DIV1 检测结果见表5。 由图5 可见，第1 次PCR 所有样品均未扩增出阳性条带；第2 次PCR，在129 bp 处扩增出条带。由表5可见，鹰爪虾阳性样品2 个，阳性率分别为28.57%；口虾蛄检出阳性样品1 个，阳性率为3.23%；日本蟳、三疣梭子蟹未检出阳性。

图5 DIV1 PCR 扩增结果

表5 海州湾海域野生甲壳动物DIV1 检测结果

2.6 急性肝胰腺坏死病检测

经2 次PCR 扩增，鹰爪虾、日本蟳、三疣梭子蟹、口虾蛄共44 个样品均未检出阳性，见图6（a）（b）。

图6 AHPND PCR 扩增检测结果

3 讨论

水生动物病原检测技术有多种方法，包括PCR、核酸杂交、电镜观察、荧光定量PCR、酶联免疫吸附技术（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）等。然而PCR 以其快速、成本低、敏感等优点仍然是当前水生动物疫病检测的主要手段[6]。但是PCR 技术，如果引物与模板结合的特异性不够、模板浓度过高、镁离子浓度过高或过低等情况下也会出现非特异性扩增[13]。本调查中，PCR 扩增特异性较好，未出现非特异性扩增现象，说明所用引物特异性较强、DNA 质量较高、反应体系较为优化。

野生水生动物携带病原多有发现，且可以通过水平和垂直方式进行传播。水平传播指生物之间相互蚕食或摄食携带病原的生物而相互感染，垂直传播指感染后存活下来的个体会终身携带病原，并可以通过繁殖的方式传播给下一代[14]。在生产过程中，水生动物苗种繁育所需亲本主要为海捕的野生亲本，势必会出现病原垂直传播的情况；养殖过程中，飞禽、浮游生物、其他甲壳动物等可能会将病原通过水平传播的方式感染养殖品种。

甲壳动物不同病原混合感染现象以往研究中也有报道。Tsai 等[15]在台湾地区的凡纳滨对虾中，检测到WSSV 和桃拉病毒（Taura Virus, TSV）混合感染现象。杨卫帆等[16]报道，养殖场的对虾中发现存在WSSV 和IHHNV 混合感染。杨丽诗等[6]研究发现，斑节对虾存在WSSV 和IHHNV 以及WSSV 和MBV 混合感染情况。本调查发现，鹰爪虾存在混合感染现象，其中1 个样品同时检测到DIV1 和EHP，1 个样品同时检测出WSSV、EHP 及IHHNV。可见甲壳动物病原混合感染现象较为常见，给甲壳动物疫病防控工作带来更大挑战。

4 结论

本调查44 个样品，仅在鹰爪虾和口虾蛄中检出阳性，阳性样品7 个，占总样品数的15.91%；共检出阳性病原10 个，其中WSSV 2 个、IHHNV 2 个、EHP 3 个、DIV1 3 个。鹰爪虾存在不同病原混合感染现象，其中1 个样品同时感染了DIV1 和EHP，1 个样品同时感染IHHNV、EHP 和WSSV。日本蟳、三疣梭子蟹均为检出病原。