17种精油对褶皱臂尾轮虫的杀灭效果试验

岳治光，赵聪，温俊奇，孙小帅，许新春，刘喜恒

（1.河南安进生物工程有限公司，河南 驻马店 463800；2．上蔡县农业综合行政执法大队，河南 驻马店 463800）

轮虫（Rotifer），属水生多细胞原生动物，富含幼苗必需的氨基酸和不饱和脂肪酸，是鱼、虾、蟹类苗期的天然饵料。但轮虫大量繁殖并摄食藻类，会导致水体达不到“肥、活、嫩、爽”的养殖标准，其代谢产生大量有机物，引起水中氨氮、亚硝酸盐氮升高；轮虫大量死亡后分解，滋生的细菌和真菌会污染水体，其泛滥极易发生翻塘事件，在我国黄河流域的精养塘危害比较严重[1]，部分鱼塘因此荒废。目前水产养殖中主要使用化学药品防治轮虫，但药品往往具有广谱性，对微藻和其他水生生物亦会产生毒性，不适于浮游动物污染控制[2-4]。植物成分的杀虫剂，具有低毒、低残留、易降解、与环境兼容性好的特点，一般被认为是化学药品的潜在替代品[5]。现以褶皱臂尾轮虫（Brachionus plicatilis）（以下简称轮虫）为研究对象，探究17种植物精油对其杀灭效果，筛选出安全高效、纯天然的轮虫防控药物，为生产中防治轮虫技术提供参考。

1 材料与方法

1.1 时间与地点

2022 年8 月，试验地位于郑州某实验室。

1.2 材料

1.2.1 轮虫

试验用轮虫购自上海某微生物培养机构，由单个孤雌生殖雌体驯化培养2 个月后，大量培养并诱导其种群产生休眠卵孵化而来[6]。

1.2.2 试剂及仪器

丁香酚（98%，20220603）、柠檬醛（94.5%，20220522）、侧柏酮（92%，20220603）、香叶醇（98%，20220603）、薄荷醇（20220211）购自江西新森化工有限公司；石竹烯（87%，D887045）、柠檬烯（98%，E809010）、桉叶素（96%，E879023）、百部碱（88%，B807765）、松油醇（98%，E595432）、香芹酚（99%，C234255）、肉桂醛（99%，B328976）、香茅醛（98%，B234432）、水杨酸甲酯（99%，D998355）、广藿香醇（90%，Z228482）、姜辣素（84%，B223552）、大蒜素（Allicin）（82%，B225112）购自广州安奈生物科技有限公司。除癞灵（含辛硫磷10%）购自河南安进生物技术股份有限公司；三苯乙烯基苯酚聚氧乙烯醚（分析纯）、正丁醇（分析纯）均购自天津恒兴化学试剂制造有限公司；体式显微镜（ZX500TR）购自深圳市众寻光学仪器有限公司；分析天平（AuW120D）购自日本SHIMADZU 仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 17种植物精油对轮虫的杀灭效果预试验

精确称取相应植物精油500 mg 置于100 mL容量瓶中，后加入4 mL 三苯乙烯基苯酚聚氧乙烯醚（乳化剂）及1 mL 正丁醇（助剂），加去离子水定容至100 mL，即得到5 g/L 浓度的相应精油微乳液母液（设不添加精油成分的溶剂对照组）。取各相应精油微乳液母液加入去离子水，将其稀释（溶剂对照组同比例稀释），每个处理组分别稀释到1，10，100 和1 000 mg/L 4 个梯度。吸取1 mL 相应梯度的精油测试液，于细胞培养板（12 孔板）中，每孔中放入30 只龄长在4 h 以内的轮虫幼体，每组每个浓度均设3 个重复，设置相同浓度梯度的辛硫磷溶液为化药对照，去离子水为空白对照。试验在（25±1）℃无光的恒温培养箱中进行，24 h 后于体视显微镜下观察，并记录每孔中轮虫死亡数，以轮虫头冠纤毛和个体运动停止作为死亡标准。

1.3.2 精油急性毒性试验

根据1.3.1 预试验中杀灭效果较好的精油，取其母液分别稀释至0.1，0.3，0.6，1.0，2.0，6.0 和10.0 mg/L 共7 个梯度，吸取1 mL 相应浓度梯度的精油测试液于细胞培养板（12 孔板）中，每孔中放入30 只龄长在4 h 以内的轮虫幼体，每组每个浓度均设3 个重复，设置相同浓度梯度的辛硫磷溶液为化药对照，去离子水为空白对照。试验在（25±1）℃无光的恒温培养箱中进行，24 h 后于体视显微镜下观察，并记录每孔中轮虫死亡数，采用SPSS 17.0 软件中Probit 法，计算各精油对轮虫24 h 的半致死浓度（LC50）。

1.3.3 复筛精油应用后轮虫在24 h 内死亡情况

根据1.3.2 的试验结果，使用相应精油微乳液母液，将其稀释至其绝对致死浓度（LC100），吸取1 mL 相应浓度梯度的精油测试液于细胞培养板（12 孔板）中，每孔中放入30 只龄长在4 h 以内的轮虫幼体，每组每个浓度均设3 个重复，设置绝对致死浓度的辛硫磷溶液为化药对照，去离子水为空白对照，在（25±1）℃无光的恒温培养箱中培养，并分别于5 min、2 h、6 h、12 h、24 h 时，观察轮虫死亡情况，记录死亡数。

1.3.4 复筛精油对轮虫群体增长防控效果评价

取对数生长期小球藻，接种至灭菌后的培养基内，接种密度为3.0×106cells/mL。用孔径为0.075 mm筛绢过滤扩大培养的轮虫，过滤水冲洗3 遍后添加至3 L 藻液中，轮虫接种密度为3～6 尾/mL。之后于光照培养箱内培养，培养温度（25±1）℃，光照条件L∶D=12 h∶12 h，待轮虫适应2 d 后，分别添加1.3.2经过初筛的各植物精油至有轮虫的培养液中，使各精油在其培养液中达到LC50，设未添加精油的轮虫培养液作为空白对照组，LC50的辛硫磷为化药对照组，每个处理设3 个重复。精油添加后，分别在1、3、5、7 d 时，取供试水体1 mL，使用浮游动物计数板统计轮虫密度。

1.4 数据处理

使用SPSS 软件进行方差分析（one-way ANOVA），对于有统计学意义组与对照组相比较，进行Dunnett’s 分析。

2 结果与分析

2.1 17种植物精油对轮虫的杀灭活性

17种植物精油4种浓度时对褶皱臂尾轮虫的杀灭活性见表1。由表1 可见，随着浓度的降低，植物精油对轮虫的杀灭活性也出现了不同程度的下降。为1 000 和100 mg/L 时，除对照组外，所有处理组均表现出100%对轮虫杀灭活性；为10 mg/L时，百部碱、香叶醇、石竹烯、松油醇对轮虫的杀灭率分别为（51.1±1.1）%，（42.2±2.2）%，（36.7±3.8）%和（34.5±2.2）%，而其他13种精油对褶皱臂尾轮虫的杀灭效果均达到100%；在1 mg/L 下，不同种类精油对褶皱臂尾轮虫的杀灭效果存在差异。其中，丁香酚、薄荷醇、柠檬烯、辛硫磷、香芹酚、大蒜素、肉桂醛对褶皱臂尾轮虫的杀灭活性较强，其杀灭率分别为（93.3±1.9）%，（87.8±2.2）%，（85.5±2.2）%，（78.9±2.9）%，（78.9±4.0）%，（75.6±2.9）%和（71.1±2.2）%，均达到70%以上，高于同浓度下其他处理组，存在统计学差异（P＜0.05）。其次为侧柏酮（44.5±4.0）%、广藿香醇（43.3±3.3）%、水杨酸甲酯（40.0±3.3）%，而柠檬醛、桉叶素、香茅醛及姜辣素对轮虫杀灭率较弱，均不足40%，仅高于对照组，存在统计学意义（P＜0.05）。另外，香叶醇、石竹烯、百部碱、松油醇在该浓度下未表现出对轮虫的杀灭活性。同时2 个对照组在试验中，褶皱臂尾轮虫均未出现死亡。因此，选取抗轮虫效果较好的丁香酚、薄荷醇、柠檬烯、香芹酚、肉桂醛、大蒜素进入下一步试验。

表1 17种植物精油4种浓度时对褶皱臂尾轮虫的杀灭活性① %

2.2 6种精油对轮虫的灭杀效果

在2.1 试验结果中，丁香酚、薄荷醇、柠檬烯、香芹酚、肉桂醛、大蒜素具有较强的对轮虫的杀灭活性，因此以该6种精油开展急性毒性试验，结果见表2。由表2 可见，通过对6种植物精油微乳液在24 h 时的致死中浓度进行比较，发现丁香酚、薄荷醇精油微乳液对供试轮虫具有较强的毒力，其LC50分别为0.462 和0.548 mg/L，其杀灭活性均超过辛硫磷，毒力分别为辛硫磷的1.294 和1.091 倍；柠檬烯、香芹酚、大蒜素、肉桂醛精油微乳液的LC50分别为0.600、0.680，0.720 和0.841 mg/L，均高于辛硫磷（0.598 mg/L），毒力分别为辛硫磷的0.997、0.879、0.831 和0.711 倍。

表2 复筛精油为0.1～10.0 g/L 时对褶皱臂尾轮虫的杀灭效果

2.3 6种精油应用后轮虫在24 h 内死亡情况

绝对致死浓度（LC100）下植物精油微乳液在24 h内对褶皱臂尾轮虫的杀灭效果见表3。由表3 可见，不同处理组对轮虫的杀灭率随时间的增加而增加，在用药后5 min 时，所有处理组供试轮虫未发现死亡；到2 h 时，丁香酚、薄荷醇、柠檬烯、辛硫磷组轮虫开始出现死亡，死亡率分别为（40.0±3.3）%，（37.8±1.1）%，（28.9±2.9）%和（17.8±2.9）%，其中丁香酚、薄荷醇对轮虫的杀灭率高于柠檬烯和辛硫磷，存在统计学差异（P＜0.05）；在6 h 时，所有处理组轮虫均不同程度死亡，其中丁香酚、薄荷醇精油微乳液供试轮虫死亡率达100%，杀灭率显著大于同时期其他处理组，差异有统计学意义（P＜0.05），其次为柠檬烯、辛硫磷、香芹酚处理组，轮虫死亡率分别为（84.5±2.2）%，（65.5±2.2）%和（55.6±4.8）%，高于大蒜素（43.3±3.3）%和肉桂醛（42.2±2.2）%处理组，存在显著差异（P＜0.05）；12 h 时，柠檬烯、辛硫磷处理组的轮虫死亡率达到100%，而其他处理组的轮虫死亡率也均高于70%，直至24 h 时，所有处理组供试轮虫均全部死亡。

表3 绝对致死浓度（LC100）下植物精油微乳液在24 h 内对褶皱臂尾轮虫的杀灭效果① %

2.4 6种精油对轮虫的群体增长的防控效果

轮虫在不同精油处理后不同时间下的种群密度变化见表4。由表4 可见，各精油在其LC50时，随着培养时间的延长，其体系内的轮虫密度均出现了不同程度的增加，其中以对照组增加幅度最大，从1 d 时的（6.67±1.20）ind/mL，增加至7 d时的（144.33±12.14）ind/mL。在用药后1 d，所有精油处理组及化药对照的轮虫密度均小于空白对照组，存在统计学意义（P＜0.05）；除空白对照组外，其他处理组的轮虫密度均为0.5～1.5 ind/mL，相互之间没有显著差异；在第3 d 时，丁香酚、薄荷醇处理组的轮虫密度分别为（1.67±0.67）和（2.33±0.88）ind/mL，小于香芹酚、大蒜素、肉桂醛、辛硫磷处理组及空白对照组，存在统计学意义（P＜0.05）；在第5 d 时，丁香酚、薄荷醇、柠檬烯处理组的轮虫密度分别为（6.33±0.67），（7.33±0.88）和（8.67±0.88）ind/mL，小于大蒜素、肉桂醛、辛硫磷处理组及空白对照组；在第7 d 时，丁香酚处理组的轮虫密度最小，为（12.0±1.52）ind/mL，小于其他处理组且存在统计学意义（P＜0.05），其次为薄荷醇，轮虫密度为（19.33±1.20）ind/mL，小于香芹酚、大蒜素、肉桂醛、辛硫磷处理组及空白对照组，存在统计学意义（P＜0.05）。

表4 轮虫在不同精油处理后不同时间下的种群密度变化①

3 讨论

轮虫是单细胞藻类的重要敌害生物，由于藻细胞生长繁殖速度快，如果轮虫的数量不多，吞食量不大，影响并不严重；但当轮虫繁殖数量增多时，吞食量也增大，便会对藻类及鱼虾产生严重的危害。目前，化学防治被认为是消灭轮虫的可行且有效的方法，一些试剂如甲苯、己烷和二甲苯，被证明对萼花臂尾轮虫和褶皱臂尾轮虫有高毒性[7]，但它们具有广谱性，也可能伤害藻类和其他水生生物；一些抗生素对轮虫也具有一定杀灭效果。孙帆等[8]采用盐酸四环素对萼花臂尾轮虫进行了急性毒性试验，将其在质量浓度为2.5，5.0，10.0，20.0，40.0 和80.0 mg/L 的环境下培养，结果表明，盐酸四环素的LC50为120.055 mg/L；朱韩等[9]研究发现，畜禽常用的抗生素诺氟沙星在不同藻密度下，对萼花臂尾轮虫表现出不同的杀灭活性诺氟沙星在1.0×106、2.0×106和4.0×106cells/mL 藻密度下的LC50分别为452.873，525.146 和526.650 mg/L；翟盼等[10]研究了质量浓度为10.0，15.0，20.0，25.0，30.0 和35.0 mg/L 的利福平，对萼花臂尾轮虫的急性毒性，当藻的密度为1.0×106cells/mL 时，其LC50为18.000 mg/L。大部分抗生素本身成本较高，不适合大规模使用。合成化学农药如有机磷和拟除虫菊酯，常被用来防治轮虫，甲基对硫磷和二嗪农可以降低轮虫物种的种群增长率[11-14]，其他合成化学农药如噻吩甲甲基，甲胺磷和杀螟松对萼花臂尾轮虫的种群生长和产卵则表现出抑制作用[15-17]。化学控制剂虽然方便、成本低，但也存在弊端，所使用的化学物质有可能被藻类吸收，同时化药成分可持续存在于养殖水体中污染水体。由于化学杀虫剂的种种局限性，从植物中寻找环境友好、安全性高、残留量低、使用经济的轮虫防控药物的研究与开发具有广阔前景，但目前关于植物源轮虫杀灭药物的研究相对较少。黄园[18]研究了苦皮藤素、印楝素、苦参碱和川楝素对褶皱臂尾轮虫的杀灭活性，结果显示，苦皮藤素和苦参碱表现出了对褶皱臂尾轮虫的高毒性，其LC50分别为0.175、0.061 mg/L，而印楝素（18.386 mg/L）和川楝素（2.132 mg/L）的毒力要明显弱于前者。

4 结论

采用不同浓度的17种植物精油，对轮虫的杀灭活性进行了试验。结果表明，柠檬烯、丁香酚、大蒜素、香芹酚、肉桂醛、薄荷醇对轮虫的杀灭效果优于其他精油，其中薄荷醇和丁香酚，对轮虫具有急性毒性，当浓度为LC100时，可在12 h 内杀灭全部供试轮虫，其毒力高于辛硫磷，在实验室条件下，可以有效抑制轮虫的种群增长。