噻虫嗪暴露对克氏原螯虾的病理损伤和生化反应的影响

田贵云，姜虎成，孙梦玲，赵彦华，薛晖*

（1.南京市高淳区两湖管理中心，江苏 南京 211300；2.江苏省淡水水产研究所，江苏 南京 210017）

噻虫嗪是一种第二代烟碱类高效低毒杀虫剂，化学式为C8H10ClN5O3S，具有更高的活性、更好的安全性、更广的杀虫谱、作用速度快、持效期长等特点，是防治稻飞虱和叶蝉等害虫的常用药剂[1]。其作用机理是可选择性抑制昆虫中枢神经系统烟酸乙酰胆碱酯酶受体，进而阻断昆虫中枢神经系统的正常传导，造成害虫出现麻痹性死亡[2]。

克氏原螯虾（Procambarus clarkii），又称小龙虾，隶属于节肢动物门（Arthropoda），甲壳纲（Crustacea），十足目（Decapoda），螯虾科（Cambaridae），原螯虾属（Procambarus），原产北美洲，现分布于世界30 多个国家和地区，已发展为分布最广、养殖最多、养殖产量最高的淡水虾类[3]。克氏原螯虾因其肉质鲜美，蛋白质和微量元素含量丰富[4]，深受消费者的青睐，在我国水产养殖中占有重要的地位，已成为研究稻田综合种养技术的模式动物[5]。

文献[6]研究发现，噻虫嗪对水生动物具有严重危害。暴露在噻虫嗪后，中华蟾蜍蝌蚪的总超氧化物歧化酶和过氧化氢酶活性逐渐降低，对抗氧化防御系统造成损害；鲫的抗氧化防御系统和神经系统功能发生紊乱，影响鲫的正常发育[7]。中华绒螯蟹暴露在噻虫嗪中，其神经系统和代谢系统也受到损伤[8]。

稻虾养殖模式中，克氏原螯虾不可避免会受到农药的毒害，严重影响了其正常生长与繁殖[9-10]。目前，关于杀虫剂噻虫啉对克氏原螯虾的毒性作用和安全性评价还未见报道。现开展噻虫嗪暴露对克氏原螯虾的病理损伤和生化反应的影响试验，探究噻虫啉对克氏原螯虾的急性毒性效应和安全浓度（SC），评价克氏原螯虾对噻虫啉的耐受能力，拟为环境农药污染防治和提高水产品安全性等提供科学依据，为克氏原螯虾养殖管理提供参考。

1 材料与方法

1.1 时间与地点

2022 年9 月中旬，试验地位于江苏省淡水水产研究所扬中基地。

1.2 材料

克氏原螯虾来自江苏省淡水水产研究所扬中基地。其体表完好、活性强、无疾病，平均体长为（8.5±1.0）cm，平均体质量为（16.5±2.0）g。试验前，将克氏原螯虾置于室内整理箱（180 cm×90 cm×20 cm）中暂养7 d，保持24 h 充氧，2 d 换水1 次，换水量为50%，及时清理池底粪便及残饵。每日08：00 和18：00 各投喂1 次，投喂量为其体质量的5%。暂养期间死亡率<2%，试验前一天停止投喂。

试验用水为曝气后的自来水，水温为（22.5±1.5）℃，养殖水质符合《渔业水质标准》（GB 11607—1989）。

1.3 试验方法

1.3.1 预试验

采取静水试验法，试验期间不投饲不换水，及时捞出死亡个体并记录。虾死亡标准为用玻璃棒触碰虾，多次刺激后没有反应，则判定为死亡。噻虫嗪质量浓度梯度设置为1，2，4，8，16 和32 mg/L，每个浓度设置3 组平行。共使用18 个聚乙烯桶（240 cm×140 cm×40 cm），每个桶暂养10 只虾，水体积100 L，持续充氧。通过预试验，确定克氏原螯虾在噻虫嗪胁迫下全部存活的最高浓度和全部致死的最低浓度。

1.3.2 正式试验

根据预试验的结果，在全部存活的噻虫嗪最高浓度和全部致死的最低浓度之间，设置5 个等对数比试验组，作为正式试验的浓度，分别为1.43，2.04，2.93，4.16 和5.97 mg/L，同时设置一个空白对照组（0 mg/L）。试验组和对照组每组设置3 组平行。共使用18 个聚乙烯桶（240 cm×140 cm×40 cm），每个桶暂养10 只虾，水体积100 L，持续充氧。每6 h 观察1 次虾的行为及体表变化，及时捞出死亡个体并记录。

1.3.3 慢性毒性试验

暴露试验在整理箱（180 cm × 90 cm × 20 cm）中进行。设置3 个试验组：对照组、52.5 μg/L（1/4 LC50）暴露组、105.0 μg/L（1/2 LC50）暴露组，每组设3 个重复。对照组盛装100 L 曝气7 d 以上的自来水，暴露组盛装100 L 对应浓度的噻虫嗪溶液。取90 只规格接近且健康的克氏原螯虾，平均分成9 份，每份10 只，分别放置于9 个整理箱内。每天定时投喂饲料，记录暴露时间及水质指标。

1.3.4 抗氧化酶活的测定

分别在噻虫嗪暴露的7 和14 d 取样，每个时间点均有52.5 和105.0 μg/L 2组，即4 个试验暴露组和1 个对照组（0 μg/L）。每组随机挑选3 只克氏原螯虾，共15 只，于冰上麻醉15 min 后解剖，取其肝胰腺（n=3），取样量为0.2 g 左右，使用PBS 冲洗血液，快速放入液氮中，于-80 ℃冰箱保存。测定酶活前，将组织样品混合生理盐水匀浆（1∶9，W/V），于4 ℃下3 500 r/min 离心10 min。分别测定总超氧化物歧化酶（T-SOD）、过氧化氢酶（CAT）、丙二醛（MDA）、谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）和还原型谷胱甘肽（GSH）值。

1.3.5 虾组织病理切片制备

每组取3 只克氏原螯虾的肝胰腺，使用PBS 冲洗其血液。吸干后放入装有4%多聚甲醛的离心管中固定24 h。随后用水冲洗组织，用由低浓度到高浓度酒精作脱水剂，逐渐脱去组织块中的水分。再将组织块置于既溶于酒精，又溶于石蜡的透明剂二甲苯中透明，以二甲苯替换出组织块的中酒精。将样品浸入石蜡中进行包埋。冷却后使用切片机进行切片。石蜡切片厚度为5 μm，使用旋转切片机（RM2016，莱卡，德国）。脱蜡后切片苏木精-伊红染色。染色切片的显微镜观察和摄影使用显微镜（Eclipse E100，尼康，日本）。

1.4 数据处理

统计试验虾在96 h 内的死亡数，并计算其死亡率。采用寇氏法（Korbor），计算噻虫嗪对克氏原螯虾的96 h 的LC50，SC 按LC50的10%来计算。数据采用Excel 进行初步处理，使用SPSS 16.0 统计软件进行分析，采用单因素方差分析（One-way ANOVA）、Least Significant Difference（LSD）和Waller-Duncan（W）检验，使用Graphpad Prism 9 软件作图，结果以“平均数±标准差”表示。病理切片观察通过Caseviewerr 软件来实现的。

2 结果与分析

2.1 噻虫嗪胁迫下克氏原螯虾的中毒症状和行为变化

52.5 μg/L 噻虫嗪暴露组克氏原螯虾活动状况与对照组相似，105.0 μg/L 噻虫嗪暴露组克氏原螯虾活力较强，在容器内作快速游动。随着暴露时间的延长，105.0 μg/L 噻虫嗪暴露组的克氏原螯虾游动速度逐渐变慢，活力减弱，对外界的刺激反应迟钝，最后死亡。克氏原螯虾的中毒死亡过程表现为：反应逐步迟缓，无激烈的抵御反应，大多为侧躺弯曲状，缩尾，当仰卧于水中时，不能自行翻转，仅附肢微弱摆动，最终死亡。

2.2 噻虫嗪对克氏原螯虾的急性毒性

不同浓度噻虫嗪胁迫下克氏原螯虾死亡情况见表1。由表1 可见，在24 h 时，只有1.43 mg/L 试验组克氏原螯虾未出现死亡，随着浓度的增加，死亡率逐步上升，在5.97 mg/L 组中克氏原螯虾死亡率达到100%。在48 h 时，2.93 和4.16 mg/L 的死亡率都维持在40%。在96 h 时，1.43 mg/L 组的死亡率依旧没有改变，但是其余组都维持在高死亡率60%～100%。空白对照组在96 h 内未出现死亡，故排除水质等外界因素对死亡情况的影响。噻虫嗪对克氏原螯虾的急性毒性分析结果见表2。

表2 噻虫嗪对克氏原螯虾的急性毒性分析结果

2.3 噻虫嗪暴露使肝胰腺发生病理损伤

对照组和噻虫嗪暴露组的肝胰腺的组织学切片见图1（A）（a）（B）（b）（C）（c）。由图1 可见，对照组肝胰腺结构整齐，管腔呈星号状（★）。与对照组相比，噻虫嗪处理组的肝胰腺有明显的组织病理学变化。噻虫嗪（52.5 和105.0 μg/L）暴露组肝胰腺组织都显示管腔扩张，以及明显的上皮空泡化（→）。

图1 不同浓度噻虫嗪对克氏原鳌虾幼虾肝胰腺组织学的影响

2.4 噻虫嗪暴露导致克氏原螯虾肝胰腺发生氧化应激

不同浓度噻虫嗪对克氏原螯肝脏T-SOD、CAT酶活性和MDA、GPX 和GSH 浓度的影响见图2（a）（b）（c）（d）（e）。由图2 可见，肝胰腺中T-SOD 的活性随着暴露时间和浓度的增加显著升高，这表明组织中产生了过量的活性氧（ROS），同时引起了抗氧化防御反应。此外，肝胰腺中产生了过量的过氧化氢（H2O2），导致CAT 酶的显著上升，在高浓度暴露7 d 后，肝胰腺CAT 酶较低浓度暴露组反而下降了。肝胰腺中MDA 含量显著上升。结合CAT 酶的数据，表明高浓度暴露7 d，肝胰腺受到严重损伤。GPX 和GSH 作为机体重要的抗过氧化物酶在肝胰腺中显著也上升。

图2 不同浓度噻虫嗪对克氏原螯肝脏T-SOD、CAT 酶活性和MDA、GPX 和GSH 浓度的影响

3 讨论

3.1 噻虫嗪暴露下克氏原螯虾的LC50 及毒性

甲壳类动物有一个开放的循环系统，在这个系统中，外界有毒物质极易进入体内并引起中毒[11]。在甲壳类急性毒性实验中，依据国家标准[12]，农药的级别根据96 hLC50可分为低毒、中毒、高毒和剧毒，分别为LC50>10 mg/L、1.0 mg/L

3.2 噻虫嗪暴露对克氏原螯虾肝胰腺的损伤

甲壳动物的肝胰腺不仅是消化腺，而且是重要的免疫器官，在外源有毒物质代谢和先天免疫系统中起重要作用。本试验发现，噻虫嗪对克氏原螯虾肝胰腺细胞的形态结构有破坏作用。肝胰腺细胞发生空泡化，管腔扩大，这些现象表明克氏原螯虾肝胰腺组织受到明显的损伤[13]。

3.3 噻虫嗪对克氏原螯虾抗氧化酶活性的影响

环境污染物可能会引起水生动物的氧化应激反应。T-SOD 是甲壳动物体内必需的保护酶。本试验中，所有噻虫嗪暴露组与对照组相比，T-SOD 活性都显著上升。此外，肝胰腺中CAT 酶的显著上升，表明产生了过量的H2O2，值得注意的是，在高浓度暴露7 d 后，CAT 酶较低浓度暴露组反而下降，推测是高浓度的噻虫嗪对肝胰腺的损伤程度远远高于低浓度的肝胰腺，导致组织无法合成足够的CAT 酶来消除过量的H2O2，导致损伤无法及时恢复。丙二醛（MDA）被认为是活性氧诱导组织损伤的主要途径，也是氧化损伤的生物标志物。在本试验中，MDA 含量显著上升，这与溴氰菊酯对克氏原螯虾的结果一致[14]，结合CAT 酶的数据，推断高浓度暴露7 d，肝胰腺受到严重损害。GPX 作为重要的机体抗过氧化物酶[15]，其浓度和GSH 都在肝胰腺中显著上升，推测是为了应对过量ROS 导致的氧化胁迫作用。

4 结论

噻虫嗪对克氏原螯虾的96h LC50为2.1 mg/L，SC 为0.21 mg/L，对克氏原螯虾毒性属于中毒级别。当克氏原螯虾暴露在105 μg/L 的噻虫嗪14 d 后，肝胰腺发生了损伤，产生过量的ROS，抗氧化酶TSOD、CAT 的活性和MDA、GPX 的浓度随着噻虫嗪的浓度上升，同时抗氧化剂GSH 的浓度也上升了。