气相色谱-串联质谱法测定牛肉中4种琥珀酸脱氢酶抑制剂类杀菌剂的残留量

吴雪梅 ,马 丽 ,何会珍 ,薛 康,2 ,刘 俊,2* ,邓惠丹

(1.成都海关技术中心,成都 610041;2.食品安全检测四川省重点实验室,成都 610041)

转基因作物的迅速发展带动了杀菌剂的市场,其中琥珀酸脱氢酶抑制剂类(SDHIs)杀菌剂尤为突出[1]。杀菌剂在保护农产品的同时,还能经食物链富集到动物体内,污染动物源性食品,从而影响人体健康[2]。2019年我国首次登记的SDHIs杀菌剂有4个,分别为氟唑菌酰羟胺、氟唑菌苯胺、吡噻菌胺和苯并烯氟菌唑。GB 2763—2021《食品安全国家标准 食品中农药最大残留限量》规定哺乳动物肉类(海洋哺乳动物除外)中吡噻菌胺和苯并烯氟菌唑的临时最大允许残留限量(MRLs)分别为0.04 mg·kg—1和0.03 mg·kg—1,但对于氟唑菌酰羟胺和氟唑菌苯胺暂无规定。

目前,文献报道的食品中农残检测方法有气相色谱-串联质谱法(GC-MS/MS)[3-5]、气相色谱-负化学电离质谱法[6]、高效液相色谱-串联质谱法[7]等,但是关于GC-MS/MS测定牛肉中SDHIs杀菌剂残留量的分析方法未见报道。因此,本工作采用改良的前处理方式,通过优化仪器工作条件,提出了GCMS/MS测定牛肉中氟唑菌酰羟胺、氟唑菌苯胺、吡噻菌胺和苯并烯氟菌唑等4种SDHIs杀菌剂残留量的方法,可为哺乳动物肉类(海洋哺乳动物除外)中氟唑菌酰羟胺和氟唑菌苯胺的MRLs制定提供方法参考。

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

GCMS-TQ8040 NX 型气相色谱-三重四极杆串联质谱仪;Turbovap LV 型全自动浓缩工作站;3 H2RI型台式冷冻离心机;AE 240 型电子天平;Milli-Q Integarl型超纯水仪。

氟唑菌酰羟胺、氟唑菌苯胺、吡噻菌胺、苯并烯氟菌唑单标准溶液:100 mg·L—1。

混合标准储备溶液:分别取氟唑菌酰羟胺、氟唑菌苯胺、吡噻菌胺、苯并烯氟菌唑单标准溶液各1.0 mL,置于10 mL 棕色容量瓶中,用正己烷稀释至刻度,混匀,配制成4种SDHIs杀菌剂质量浓度均为10 mg·L—1的混合标准储备溶液。

混合标准使用液:取混合标准储备溶液1.0 mL,置于10 mL 棕色容量瓶中,用正己烷稀释至刻度,混匀,配制成4种SDHIs杀菌剂质量浓度均为1 mg·L—1的混合标准使用液,临用现配。

环己烷、乙酸乙酯、乙腈、正己烷均为色谱纯;无水硫酸钠为分析纯;试验用水为超纯水。

1.2 仪器工作条件

1.2.1 色谱条件

SH-I-5Sil MS石英毛细管柱(30 m×0.25 mm,0.25μm);载气为高纯氦气(纯度不小于99.999%),流量1.2 mL·min—1;进样量1μL,不分流进样。柱升温程序:初始温度50℃,保持1 min;以25 ℃·min—1速率升温至125 ℃;再以10 ℃·min—1速率升温至300 ℃,保持7 min。

1.2.2 质谱条件

溶剂延迟时间14 min;电子轰击离子源,离子源能量70 e V;进样口温度250 ℃,离子源温度200 ℃,接口温度250 ℃;多反应监测(MRM)模式。

其他质谱参数见表1。

表1 质谱参数Tab.1 MS parameters

1.3 试验方法

取不少于500 g的牛肉样品,用绞肉机绞碎成糜,充分混匀后装入清洁密封袋,于—18 ℃冷冻保存。

取5 g(精确至0.01 g)处理后的牛肉样品,置于50 mL离心管中,加入10 mL 体积比1∶1的环己烷-乙酸乙酯混合溶液和1个转子,用均质器以转速15 000 r·min—1提取1.5 min后,加入5 g无水硫酸钠,再以转速10 000 r·min—1离心5.0 min。取上清液于15 mL玻璃试管中,于40 ℃水浴氮吹至近干,残渣再用10 mL 体积比1∶1的环己烷-乙酸乙酯混合溶液重复提取一次,离心后,取上清液于上述15 mL玻璃试管中继续氮吹至近干。在上述玻璃试管中加入2.0 mL 乙腈溶解残渣,混匀,以转速3 000 r·min—1离心2.0 min。分取1.0 mL 乙腈层,于40℃水浴氮吹至近干,用1.0 mL正己烷溶解残渣,过0.22μm 有机滤膜,滤液按照仪器工作条件进行测定。

2 结果与讨论

2.1 质谱条件的优化

分别对质量浓度均为10 mg·L—1的吡噻菌胺、氟唑菌苯胺、氟唑菌酰羟胺、苯并烯氟菌唑单标准溶液在m/z50～500内进行全扫描,得到各目标物的一级质谱图和保留时间;从一级质谱图中选择灵敏度高、m/z较大(m/z大于100)的离子为各目标物的母离子。对选定的母离子进行二级质谱扫描,选择响应强度较高的离子作为子离子;对各离子对进行碰撞能量优化。优化后的质谱参数见表1,4 种SDHIs杀菌剂的总离子流色谱图见图1。

图1 4种SDHIs杀菌剂的总离子流色谱图Fig.1 Total ion chromatogram of 4 SDHIs fungicides

2.2 前处理条件的优化

2.2.1 提取溶剂

参考国家标准GB/T 23210—2008《牛奶和奶粉中511种农药及相关化学品残留量的测定 气相色谱-质谱法》和GB/T 19650—2006《动物肌肉中478种农药及相关化学品残留量的测定 气相色谱-质谱法》,考察了乙腈和体积比1∶1的环己烷-乙酸乙酯混合溶液分别为提取溶剂时对空白加标样品中4种SDHIs杀菌剂回收率的影响。结果表明:以乙腈为提取溶剂时,4种目标物的回收率为15.7%～21.9%;以体积比1∶1的环己烷-乙酸乙酯混合溶液为提取溶剂时,4 种目标物的回收率提高至75.8%～92.1%。因此,试验选择的提取溶剂为体积比1∶1的环己烷-乙酸乙酯混合溶液。

2.2.2 净化溶剂和定容液

样品经提取、氮吹至近干后仍有油脂残留,为减少干扰,需要加入一定量的净化溶剂。试验考察了乙腈饱和的正己烷溶液(先加入1.0 mL 乙腈溶解残渣,再加入2.0 mL 乙腈饱和的正己烷溶液净化)和乙腈分别为净化溶剂时对空白加标样品中4 种SDHIs杀菌剂回收率的影响。结果表明:以乙腈饱和的正己烷溶液净化时,4 种目标物的回收率为30.6%～52.7%;以乙腈净化时,4种目标物的回收率为89.8%～105%。因此,试验选择的净化溶剂为乙腈。

由于乙腈极性过大,以乙腈溶解残渣上机检测时可能损害色谱柱及仪器;另一方面,乙腈沸点为81～82 ℃,正己烷沸点为69 ℃,在初始柱温50 ℃条件下正己烷更容易气化。因此,试验选择的定容液为正己烷。

2.3 基质效应

牛肉属于高蛋白、高脂肪类食物,其中的蛋白质、脂肪等杂质容易造成基质效应(ME),对GCMS/MS的定量分析产生干扰。按照公式(1)计算ME值。若ME值大于0,则为基质增强效应;反之则为基质抑制效应。

经计算,吡噻菌胺、氟唑菌苯胺、氟唑菌酰羟胺、苯并烯氟菌唑的ME 值分别为8.7%,1.0%,6.0%,10.4%。为了能够同时检测4种目标物,且确保测定结果的准确度,试验采用基质匹配法绘制工作曲线[8]。

2.4 工作曲线、检出限和测定下限

用空白基质溶液稀释混合标准使用液,并定容至1.0 mL,配制成质量浓度为0.2,0.5,1.0,2.0,5.0,10.0,20.0μg·L—1的基质匹配的混合标准溶液系列。按照仪器工作条件进行测定,以各目标物的质量浓度为横坐标,对应的峰面积为纵坐标绘制工作曲线。结果显示:4种SDHIs杀菌剂工作曲线的线性范围均为0.2～20.0μg·L—1,线性参数见表2。

表2 线性回归方程、相关系数、检出限和测定下限Tab.2 Linear regression equations,correlation coefficients,detection limits and lower limits of determination

分别以3,10倍信噪比(S/N)计算检出限(3S/N)和测定下限(10S/N),结果见表2。

2.5 精密度和回收试验

对空白样品进行3 个浓度水平的加标回收试验,每个浓度水平平行测定6次,计算回收率和测定值的相对标准偏差(RSD),结果见表3。

表3 精密度和回收试验结果(n＝6)Tab.3 Results of tests for precision and recovery(n＝6)

由表3 可知:4 种SDHIs杀菌剂的回收率为89.8%～105%,测定值的RSD 为0.74%～4.5%。

2.6 样品分析

按照试验方法对市场随机采样和送检的12份牛肉样品进行分析。结果显示,12份样品中均未检出4种SDHIs杀菌剂。

本工作提出了GC-MS/MS 测定牛肉中4 种SDHIs杀菌剂残留量的方法。相比于使用较多的Qu ECh ERS、凝胶渗透色谱法和固相萃取法,本工作前处理操作更加简便、省时,而且抗干扰效果较好,准确度、精密度、灵敏度均良好,为检测牛肉等动物源性食品中SDHIs杀菌剂的残留量提供了方法参考。