5个不同品系迷迭香精油对金线莲尖孢镰刀菌的抑菌活性及GC-MS成分分析

李珊珊，邹 晖，杨 敏，林江波，戴艺民，吴维坚

（福建省农业科学院亚热带农业研究所，漳州 363005）

金线莲Anoectochilusroxburghii（Wall.） Lindl.[1]学名金线兰，又称花叶开唇兰，兰科开唇兰属A.Blume植物；产于浙江、江西、福建、等省，日本、泰国、老挝、越南等多个国家也有分布，本变种全草民间可作药用[2]。作为闽台特色中草药，金线莲的民间临床应用广泛，素有“药王”“神药”“鸟人参”之称[3]。其味甘，性平[4]、凉；归肺、肝、肾、膀胱经；有清热凉血、除湿解毒的功效，主肺热咳血、肺结核咯血、尿血、小儿惊风、破伤风、肾炎水肿、风湿痹痛和跌打损伤[5]。因过度开采，加之自然竞争力差，造成野生金线莲资源稀缺，《国家重点保护野生植物名录》（第二批）已将野生金线莲列为二级保护植物，目前市场上流通的金线莲以人工培养无性繁殖苗为主[6]，随着金线莲栽培面积不断扩大，茎腐病不断蔓延扩散，已成为福建省金线莲的重要病害之一，严重威胁金线莲产业的发展[7]。

已知金线莲茎腐病的致病菌为尖孢镰刀菌Fusariumoxysporum[8]。尖孢镰刀菌是常见的植物病原真菌，被列为世界第三大土传病原真菌，可诱发100 种以上植物的枯萎病[9]，会导致多种经济作物的根腐、茎腐和维管束枯萎病等[10]。目前能防治尖孢镰刀菌的化学药剂对周围环境、微生物甚至人体都存在安全隐患[11]，有效且安全的环境友好型杀菌剂尚待研究[12]。

植物精油是一类从植物中提取的次生代谢产物[13]，可通过水蒸汽蒸馏等方法从植物的花、叶、茎、根等部位获取[14]，因其抗菌、杀菌活性[15]被做为合成农药的安全替代品而受到越来越广泛的关注[16]。有研究证实，香青兰DracocephalummoldavicaL.[17]、留兰香MenthaspicataL.、欧薄荷M.longifolia(L.) Hudson[18]、牛至OriganumvulgareL.[19]、滨香草ThymbraSpicataL.和迷迭香RosmarinusofficinalisL.[20]等多种唇形科LamiaceaeMartinov 植物精油对尖孢镰刀菌具有抑制活性。

虽然迷迭香精油已被证实对尖孢镰刀菌具有抑制活性，但现有研究使用的均为迷迭香原生种，且并未明确其中起主要抑制作用的具体成分。本研究通过水蒸汽蒸馏法提取漳州产5 个不同品系迷迭香的精油，以分离自发病金线莲的尖孢镰刀菌为供试菌种，评价迷迭香精油对该病原菌的抑菌活性，为植物源杀菌剂的开发利用提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 迷迭香和匍匐迷迭香均引自中国台湾，伍德迷迭香、阔叶迷迭香和粉花迷迭香引自浙江宁波，均保育于福建省农业科学院亚热带农业研究所芳香植物资源圃，为露地栽培2 年以上品种。供试植物信息详见表1。

表1 供试植物信息Table 1 Directory of tested plants

1.1.2 供试病原菌 尖孢镰刀菌分离自金线莲茎腐病发病株，保存于福建省农业科学院亚热带农业研究所植物病理学实验室（基因GenBank 登录号：OQ244517.1），根据Koch 氏法则将爬满菌丝的接种针回接金线莲无菌苗茎基部，以无菌水浸泡的接种针做为空白对照，确定供试病原菌具有显著致病性[21]。

1.1.3 供试培养基 马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂20 g，超纯水1000 mL。

1.1.4 实验仪器及化学试剂 挥发油测定器（密度＜1.0）、球形冷凝管、圆底烧瓶及其他玻璃器皿，漳州市腾信化玻仪器有限公司；XB.K.25 血球计数板，上海市求精生化试剂仪器有限公司；电热套，巩义市予华仪器有限责任公司；Basic-Q15-IT 纯水机，上海和泰仪器有限公司；GF54DA 立式自动压力蒸汽灭菌器，致微（厦门）仪器有限公司；MJ-250 恒温光照培养箱，上海一恒科学仪器有限公司；SW-CJ-1F 洁净工作台，苏净集团苏州安泰空气技术有限公司；Trace 1300/TSQ9000 气相色谱-质谱联用仪，美国Thermo Fisher Scientific 公司；皇家园艺学会（Royal Horticultural Society，RHS）植物比色卡（2015），英国皇家园艺学会；制霉菌素（nystatin）、正己烷标准溶液[n-Hexane，≥99%（GC）]，上海麦克林生化科技股份有限公司；二甲基亚砜（DMSO）分子生物学级，生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 迷迭香精油提取及含量测定 挥发油测定法[22]提取并测定不同品系迷迭香鲜叶的精油含量，略有改动。供试样品统一选择栽培2 年以上植株，于晴天的早上9 点之前，采用五点式采样法收集嫩梢距顶端15 cm之内干净无露水无浇灌水的新鲜叶片置于1000 mL 硬质圆底烧瓶内，每瓶200 g，加水300 mL，振摇混合后，连接挥发油测定器与回流冷凝管。自冷凝管上端加蒸馏水使充满挥发油测定器的刻度部分，并溢流入烧瓶时为止。烧瓶置电热套中缓慢加热至瓶内液面沸腾，保持微沸5 h，停止加热1 h 后读取精油容积，RHS 植物比色卡比对油色，计算供试品的精油含量并收集于棕色试剂瓶内26 ℃以下密封保存备用，精油含量（%）＝精油容积（mL）/样品鲜重（g）×100。

1.2.2 抑菌活性筛选及EC50值测定 菌丝生长抑制法[17]进行4 个迷迭香栽培变种精油的抑菌活性筛选，略有改动。试验分为2 个阶段：第1 阶段设计1 个空白对照和3 个浓度梯度，以迷迭香精油为阳性对照。在无菌条件下，分别向三角瓶中加入40、20 和10 μL 供试精油，用灭菌PDA 培养基分别定容至40 mL，配置成浓度为1.00、0.50、0.25 μL/mL 的含药培养基，倒入直径90 mm 的无菌培养皿，制成相应浓度的含药平板。设不加精油的PDA 培养基为空白对照。第2 阶段根据第1 阶段的试验结果，利用SPSS 软件对实验数据进行分析筛选出抑菌活性最佳的2 种精油，根据抑菌率制定回归方程y=b+ax，预测其可抑制尖孢镰刀菌的半数有效浓度（EC50）；以此浓度为参考，同样采用上述方法设计 3 个浓度梯进行抑菌活性筛选，设含10 μL/mL DMSO 的PDA 培养基为空白对照，以相同浓度的DMSO 为不同处理中精油的溶剂，将2 mg 制霉菌素溶解于DMSO 中并定容至400 μL，再用灭菌PDA 定容至40 mL，制得0.005%含药平板，以此为阳性对照[18]。

菌饼制备：在无菌条件下取直径6 mm 的滤纸浸泡于浓度为106～107CFU/mL 的菌悬液中备用。

接种：在无菌条件下取菌饼分别置于含药平板及空白对照平板中心，将培养基置于恒温培养箱（28 ℃）中，正置暗培养24 h，倒置暗培养6～9 d。

活性测定方法[23]：待对照组菌丝接近培养皿边缘时，采用十字交叉法测量菌落直径（cm），重复3次，取平均值，计算抑制率，抑制率（%）＝（对照菌落直径－处理菌落直径）/（对照菌落直径－菌饼直径）×100。利用Microsoft Excel 计算相对抑制率，利用SPSS V13.0 软件进行单因素方差分析及毒力回归方程计算。

1.2.3 气相色谱-质谱联用仪（Gas chromatograph- mass spectrometer，GC-MS）测定精油化学成分 每种精油均以正己烷稀释为5 μL/mL 的混合溶液，以正己烷标准品做为进样针清洗剂，分别进行GC-MS 成分分析。

气相色谱条件：Thermo TG-5SilMS GC 极性柱（长度30 m，内径0.25 mm，膜厚0.25 μm）；进样口温度：250 ℃；进样量：0.4 μL，分流比1:50，载气：氦气。升温程序：起始温度50 ℃，停留5 min，以5 ℃/min 的速度升至160 ℃，再以10 ℃/min 升温至250 ℃，保持5 min。

质谱条件：EI 电离方式，EI 离子源温度：210 ℃；传输线温度：250 ℃，电子倍增电压：1847 V；电离电压：70 eV；离子源温度：300 ℃；扫描质量范围（m/z）：30～550，通过谱库检索和资料分析，结合文献进行人工谱图解析确定各化学成分，依据总离子流各色谱峰平均峰面积，运用峰面积归一化法求得各成分的相对含量，小数点后保留二位有效数字。

1.2.4 目标核心成分筛选 结合抑菌活性测试及精油成分分析结果，利用Simca 14.1 对供试的5 种精油进行主成分分析（Principal Component Analysis，PCA），从中筛选可能存在抑菌活性的目标功能成分。

2 结果与分析

2.1 迷迭香鲜叶精油含量及油色

水蒸汽蒸馏法回流提取收集的5 个品系迷迭香精油含量及油色如表2 所示。粉花迷迭香鲜叶的含油量与阳性对照接近，无显著差异；伍德迷迭香含油量显著低于粉花迷迭香及阳性对照，与匍匐迷迭香含油量接近；阔叶迷迭香叶的含油量最低，与其他品系之间存在极显著差异。从油色上看，虽然不同迷迭香精油的颜色存在少许差异，但总体来说阔叶迷迭香精油的颜色与阳性对照较为接近，匍匐迷迭香与伍德迷迭香精油的颜色较为接近，粉花迷迭香油的颜色最淡，与其他四者差异较大。

表2 5 种迷迭香叶精油含量及油色对比Table 2 Comparison of essential oil content and oil colour from leaves of 5 rosemary varieties

2.2 不同迷迭香精油的抑菌活性筛选及EC50 测定

2.2.1 抑菌活性筛选 5 个品系迷迭香精油对尖孢镰刀菌的抑菌活性如表3 所示，采用SPSS 对同一浓度下不同精油的抑菌率进行单因素方差分析可知，在精油体积浓度为1.00 μL/mL 时不同品系迷迭香精油的抑菌率均表现出极显著差异，其中匍匐迷迭香油的抑菌率最高，达27.13%，阔叶迷迭香的抑菌率最低，仅8.44%；除阔叶迷迭香外，其余品系精油的抑菌率均极显著优于阳性对照。当精油体积浓度为0.50 μL/mL时，匍匐迷迭香及伍德迷迭香精油的抑菌率极显著优于其他品系及阳性对照，仍以匍匐迷迭香精油的抑菌率最高，达19.92%。当精油体积浓度为0.25 μL/mL 时，阔叶迷迭香油的抑菌率最高，达2.36%，显著优于匍匐迷迭香，极显著优于其他品系；其中，阳性对照、伍德迷迭香和粉花迷迭香在该浓度下无抑菌活性。从方差分析的整体结果来看，5 种精油的抑菌活性与添加浓度均为正相关，当浓度达到1.00 μL/mL 时出现极显著差异，其中匍匐迷迭香及粉花迷迭香的抑菌表现最为突出。

表3 迷迭香精油对尖孢镰刀菌的抑菌活性Table 3 Fungicial activity of rosemary essential oils against F.oxysporum

2.2.2 匍匐迷迭香及粉花迷迭香精油EC50值测定 利用SPSS 计算匍匐迷迭香及粉花迷迭香油对尖孢镰刀菌的EC50值结果如表4。匍匐迷迭香油对尖孢镰刀菌的EC50值约为1.719 μL/mL。粉花迷迭香油对尖孢镰刀菌的EC50值约为1.856 μL/mL。

表4 2 种迷迭香精油对尖孢镰刀菌的EC50 值和EC95 值Table 4 EC50 and EC95 value of the essential oil from leaves of 2 rosemary varieties

以预测的浓度为参考值设置浓度梯度，将匍匐迷迭香精油和粉花迷迭香精油分别配置成浓度为0.25%、0.20%和0.15%的含药平板。

抑菌效果如图1 及表5 所示。从结果可知，在同等浓度情况下匍匐迷迭香精油对尖孢镰刀菌的抑制效果极显著优于阳性对照和粉花迷迭香。当匍匐迷迭香精油的添加浓度高于0.15%时抑菌率高于50%；粉花迷迭香精油的添加浓度需达到0.25%时抑菌率高于50%。以此初步确定匍匐迷迭香和粉花迷迭香对尖孢镰刀菌的EC50分别为0.15%和0.25%。

图1 28 ℃培养7 d 后2 种迷迭香精油不同浓度下对尖孢镰刀菌菌丝生长抑制效果Fig.1 Effects of the two studied EOs at different concentrations on mycelial growth reduction results of F.oxysporum after 7 days of incubation at 28 ℃

表5 2 种迷迭香精油对尖孢镰刀菌的抑菌效果Table 5 Bacteriostatic effect of the essential oil from leaves of 2 rosemary varieties

2.3 GC-MS 分析迷迭香叶精油的挥发性成分

经GC-MS 检测鉴定，发现不同栽培变种的迷迭香精油，其成分含量略有差异。从图2-6 可以看出，迷迭香和伍德迷迭香的精油成分较为接近，含量最高的成分均为α-蒎烯；匍匐迷迭香和阔叶迷迭香的精油成分较为接近，含量最高的成分均为桉叶油醇和樟脑；粉花迷迭香与其余4 个品种迷迭香的精油成分差异较大，含量最高的成分为β-蒎烯。

图2 迷迭香精油色谱图Fig.2 Chromatogram of essential oil from Rosmarinus officinalis L.

图3 匍匐迷迭香精油色谱图Fig.3 Chromatogram of essential oil from Rosmarinus officinalis L.‘Severn sea’

图5 阔叶迷迭香精油色谱图Fig.5 Chromatogram of essential oil from Rosmarinus officinalis L.‘Rex’

图6 粉花迷迭香精油色谱图Fig.6 Chromatogram of essential oil from Rosmarinus officinalis L.‘Majorca Pink’

由表6 的质谱分析结果可知，迷迭香叶中含量最高的3 种成分依次是：α-蒎烯（29.58%）、桉叶油醇（20.69%）和马鞭草酮（14.87%）。匍匐迷迭香叶中含量最高的3 种成分依次是：桉叶油醇（19.32%）、樟脑（19.06%）和α-蒎烯（13.44%）。伍德迷迭香叶中含量最高的3 种成分依次是：α-蒎烯（36.09%）、桉叶油醇（10.20%）和马鞭草酮（8.08%）。阔叶迷迭香叶中含量最高的3 种成分依次是：樟脑（16.92%）、桉叶油醇（14.59%）和乙酸龙脑酯（8.79%）。粉花迷迭香叶中含量最高的3 种成分依次是：β-蒎烯（28.79%）、樟脑（15.20%）和α-蒎烯（13.83%）。可以看出，5 种迷迭香精油的成分中含量最高的均为单萜类化合物。

表6 5 种迷迭香精油化学成分分析Table 6 Chemical constituents of essential oil from 5 species of rosemaries

2.4 目标成分筛选

利用Simca 14.1 对供试精油进行主成分分析（PCA）结果见图7。在所有供试成分中，与尖孢镰刀菌的抑制率呈正相关的成分为樟脑、桉叶油醇、β-蒎烯、内-龙脑、乙酸龙脑酯、d-柠檬烯、莰烯、α-松油醇和十二烷；其中樟脑、桉叶油醇和β-蒎烯的贡献率最大。

图7 与抑菌率呈正相关的成分得分图Fig.7 Composition score chart with positive correlation with bacteriostatic rate

3 讨论

目前国内外对于植物精油及其中单萜类化合物对真菌具有抑制活性的研究屡见报道[24-27]。其中迷迭香（原生种）精油被发现对黄瓜尖孢镰刀菌及甜瓜尖孢镰刀菌均具有抑菌活性[20]。迷迭香做为唇形科常绿灌木，原产欧洲及北非地中海沿岸，曹魏时引入我国[28]，经多年栽培已出现多份栽培变种，但对其相关研究多集中于种植技术、精油成分及抗氧化活性等方面，对同一地区产不同栽培变种迷迭香的出油率及抑菌活性方面的比较仍较罕见[29]。经顶空固相微萃取法测试不同变种迷迭香鲜叶中的挥发性成分可知，其所含成分之间存在差异[30,31]。其中或存在对尖孢镰刀菌的抑菌活性优于原生种的更佳选择。

从本文可知，无论从直观的油色判断，还是通过GC-MS 成分分析，迷迭香不同变种的叶片中提取的精油所含成分确实存在差异，其中匍匐迷迭香和粉花迷迭香精油对目标菌种的抑菌活性均极显著高于迷迭香原生种，这一结论为进一步筛选植物源抑菌剂的原材料方面开拓了新的思路。

普遍认为抑菌活性或与精油中含量较高的成分呈正相关，经研究发现，虽然5 种迷迭香精油在适当的浓度下均存在抑菌活性，但其中诸如α-蒎烯和马鞭草酮这一类高含量物质对尖孢镰刀菌的抑制率并未呈现正相关，而内-龙脑、乙酸龙脑酯及d-柠檬烯这些易被忽略的微量成分反而对迷迭香精油的抑制活性表现出正向贡献值。本研究也进一步明确了可抑制尖孢镰刀菌的主要目标活性成分樟脑、桉叶油醇和β-蒎烯。

有研究发现樟脑虽然无法破坏大肠杆菌的菌体结构，但可以抑制其代谢、趋化性和某些抗性反应，对大肠杆菌具有强烈的抑制效果[32]；桉叶油醇可破坏兰州百合病原细菌B-6 的菌体结构并使菌丝表现出大量褶皱、断裂和扭曲[33]；β-蒎烯可有效抑制意大利青霉菌孢子的萌发与芽管伸长，进而损伤青霉菌的细胞壁结构[34]。以上发现或与迷迭香精油对尖孢镰刀菌具有抑菌活性有关，但确切的抑菌作用机制尚未明确，值得进一步研究，为新型植物源杀菌剂主要活性成分的合成提供依据。