基于GC-MS及电子鼻技术结合化学计量法表征8 种白桃关键香气的差异

刘格格，毕金峰，苟 敏，吕 健，吴昕烨，陈芹芹*

（中国农业科学院农产品加工研究所，农业农村部农产品加工重点实验室，北京 100193）

桃子（Prunus persica(L.) Batsch）是主要的经济型核果，因其口感、香气、色泽、质地、形状和营养价值而备受赞誉[1]。世界上有3 000多个桃品种，而我国培育了1 000多个品质差异显著的品种[2-3]，主要包括普通白肉桃、黄桃、油桃和蟠桃，其中以普通白肉桃居多[4]。香气是衡量水果风味和产品品质的重要指标[5]，桃原料的香气成分影响其加工产品的风味品质[6]，研究不同品种桃果实总体香气的差异有利于原料品种培优及加工产品品质的提升。

电子鼻作为一种无损检测技术，在果蔬总体香气区分与果实质量控制等方面得到了广泛应用[7-9]，其通过不同传感器的响应实现对不同样品总体香气的有效区分，具有操作简单和快速的优势，但缺乏定性及定量方法[10]。张鑫[11]和范霞[12]等分别通过电子鼻技术对不同成熟度黄桃和不同贮藏期白桃的总体香气进行有效区分。顶空固相微萃取-气相色谱-质谱（headspace solid-phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry，HS-SPME-GC-MS）联用作为一种成熟的挥发性物质检测技术在桃果实中得到充分应用，其可以对样品中的挥发性成分进行定性和定量分析[13]，具有灵敏度高等特点。电子鼻联合HS-SPME-GC-MS技术可以全面分析黄桃干脆片[9]和不同肉质桃子[14]中总体香气的差异，刘学艳[15]和王永伦[16]等分别采用电子鼻结合HS-SPME-GC-MS技术并通过相对气味活度值（relative odor activity value，ROAV）和主成分分析（principal component analysis，PCA）实现了对勐海县晒青茶和不同干燥条件下真姬菇菌柄与菌盖中挥发性物质种类及其相对含量的鉴定。目前普通白肉桃[2,17]及桃汁[6]中的关键香气成分已有相关研究，但是不同品种间白桃的关键香气差异仍有较大研究空间。

本研究以8 个品种白桃为实验对象，基于HS-SPMEGC-MS联合电子鼻技术对不同品种白桃总体香气轮廓及香气成分进行定性定量分析，并结合化学计量法对比分析影响8 种白桃总体香气的关键香气成分，为白桃加工企业原料选择提供一定的基础理论支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

白银桃（B Y T）、陇蜜5 号（L M 5 H）、秋彤（QT）、新大久保（XDJB）、颐红水蜜（YHSM）、岗山白（GSB）6 种白桃采自国家果树种质北京桃种质资源圃，新川中岛（XCZD）桃由现代桃产业体系昆明实验站提供，颐红蜜（YHM）桃由现代桃产业体系泰安实验站提供。8 个品种白桃实物如图1所示。

图1 8 种白桃外观形态图Fig.1 Visual appearance of eight white-fleshed peach cultivars

2-甲基吡嗪（内标）、甲醇（纯度99%） 上海麦克林生化科技有限公司；C7～C40正构烷烃（纯度99%）美国Sigma-Aldrich公司。

1.2 仪器与设备

AUW220电子天平、GCMS-QP 2020 NX气相色谱-质谱联用仪 日本岛津公司；PEN 3.5型电子鼻德国Airsence公司；CTC PAL RSI自动进样机械臂广州智达实验室科技有限公司；DB-WAX型毛细管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm） 美国Agilent公司；5 0/3 0 μ m 二乙烯基苯/碳分子筛/聚二甲基硅氧烷（divinylbenzene/carboxen/polydimethylsiloxane，DVB/CAR/PDMS）萃取头 美国Supelco公司。

1.3 方法

1.3.1 样品制备

桃子采摘后放置18 ℃条件下贮藏2 h，挑选九成熟、果实饱满、色泽好、无机械损伤和无腐败变质的新鲜白桃进行清洗，之后进行劈半、去核、切块处理，将1 kg左右的白桃块放入破壁机中以32 000 r/min打浆2 min，得到色泽均一、风味浓郁的浆状样品。得到的白桃浆立即使用或放置-40 ℃条件下便于后期使用。

1.3.2 电子鼻检测

参考李嘉欣等[18]方法并稍微修改。取2.0 g浆状样品置于20 mL顶空进样瓶中，采用PEN 3.5型电子鼻进行检测，载气流速、进样流速0.30 L/min；传感器清洗时间180 s，采样前等待15 s，样品测试时间为60 s。

1.3.3 HS-SPME-GC-MS分析

1.3.3.1 HS-SPME条件

参考Gou Min等[19]方法并稍作修改。取2.0 g浆状样品置于20 mL顶空进样瓶中，向顶空进样瓶中加入0.6 g NaCl，并加入15 μL 2-甲基吡嗪（509.85 μg/mL，溶于甲醇溶液）作为内标，用聚四氟乙烯硅胶塞将顶空瓶口密封。萃取前将DVB/CAR/PDMS萃取头在250 ℃老化30 min；样品在45 ℃平衡30 min后，萃取40 min；萃取完成后在进样口解吸3 min。

1.3.3.2 GC-MS分析

参考Gou Min等[19]方法并稍作修改。

GC条件：DB-WAX毛细管柱（30 m×0.25 mm，0.2 5 μ m）；初始柱温3 0 ℃，以4 ℃/m i n 升温至150 ℃，然后以5 ℃/min升至240 ℃，并保持5 min；进样口温度250 ℃；载气为氦气，流速1.0 mL/min，不分流模式进样。

MS：质谱接口温度250 ℃；离子源温度为230 ℃；电子电离源；能量70 eV；检测器电压0.2 kV；质量扫描范围m/z35～500；溶剂延迟时间3 min。

1.3.4 定性分析

质谱库：对比分析样品中挥发性成分质谱和NIST 17数据库中标准化合物的质谱，选取相似度在80以上的组分，初步确定化合物。

保留指数（retention index，RI）：根据混合正构烷烃（C7～C40）标准品，与样品保持相同的GC-MS条件，得到的保留时间计算挥发性化合物的RI。RI按式（1）计算：

式中：n和n＋1为正构烷烃的碳数；ti为i组分的保留时间（处于Cn和Cn＋1之间）/min；tn为正构烷烃Cn的保留时间/min；tn＋1为正构烷烃Cn＋1的保留时间/min。

1.3.5 定量分析

采用内标半定量方法。根据被测各组分与内标物峰面积的比值，计算求得各组分的含量，按式（2）计算：

1.3.6 ROAV分析

参考刘登勇[20]和王永伦[16]等的方法并稍微修改，首先计算各组分的气味活度值（odor activity value，OAV），按式（3）计算：

式中：C为某组分的含量/（µg/kg）；T为该组分的感觉阈值/（mg/kg）。

在各组分OAV基础上，将OAV最大的组分的数值定义为：ROAVmax=100，按式（4）计算其他组分ROAV：

式中：OAVi和OAVmax分别为某组分和ROAVmax的气味活度值；Ci和Cmax分别为某组分和ROAVmax的含量/（µg/kg）；Ti和Tmax分别为某组分和ROAVmax组分的感觉阈值/（mg/kg）。

1.4 数据处理

使用Excel 2019进行数值计算；使用MetaboAnalyst（www.metaboanalyst.ca）对电子鼻及GC-MS数据进行分析并绘制PCA图；使用OriginPro 2021软件作电子鼻雷达指纹图和柱状图；使用Tbtools绘制香气化合物聚类分析热图；使用在线免费平台OmicShare tools（https://www.omicshare.com/tools）和Bioladder（https://www.bioladder.cn/）绘制Venn图和Sankey图。样品均重复测定3 次。

2 结果与分析

2.1 电子鼻结果分析

2.1.1 雷达指纹图谱分析

根据电子鼻传感器响应值绘制雷达指纹图，见图2。W1W和W5S两个传感器的响应值存在差异，说明不同品种白桃中硫化物和氮氧化物的含量具有一定的差异。LM5H和GSB在W1W和W5S两个传感器中呈现相对最大和最小的响应值，说明这2 种白桃的总体香气存在显著差异。同时，8 种白桃在W2W和W1S两个传感器中产生不同的信号，但响应值均小于W1W和W5S，这说明不同品种白桃在芳香成分和甲基类物质含量上具有一定的差异。同时，严娟等[21]利用电子鼻技术研究桃果实中的香气，证实硫化氢（W1W）、氮氧化物类（W5S）、甲烷类（W1S）、芳香成分与有机硫化物（W2W）传感器在果实总体香气评价中起主要作用，与本实验结果保持一致。

图2 不同品种白桃雷达指纹图Fig.2 Radar fingerprint of electronic nose sensor responses to eight white-fleshed peach cultivars

2.1.2 PCA结果

基于电子鼻不同传感器响应值结果进一步进行PCA（图3），PC1和PC2贡献率分别为98.83%和0.52%，累计贡献率达到99.35%，可以反映出8 种白桃之间总体香气的差异[22]。XCZD、LM5H和BYT之间距离较近，说明其总体香气具有较高的相似性，GSB距离XCZD、LM5H和BYT之间较远，说明它们之间的总体香气差异相对较大，YHM、YHSM和XDJB之间相对于其他样品距离较近，说明彼此之间香气存在一定的相似性。不同品种白桃的挥发性成分对PEN 3.5电子鼻中10 个传感器的敏感度不同，对最终结果产生一定的影响[23]。因此，在电子鼻分析桃总体香气轮廓差异的基础上，进一步采用GC-MS对其挥发性成分种类及含量进行鉴定分析。

图3 不同品种白桃样品PCA图Fig.3 PCA plot of eight white-fleshed peach cultivars

2.2 挥发性成分分析

已有研究表明酯类、内酯类、醛类、醇类和酮类物质是桃中主要的香气成分[22]。对HS-SPME-GC-MS技术检测不同品种白桃中的挥发性成分进行分析，结果见表1，并绘制挥发性成分热图（图4）。8 种白桃中共检测到100 种挥发性物质，其中包括内酯类8 种、酯类14 种、醛类15 种、醇类26 种、酮类14 种、烷烃类11 种、酸类3 种和其他类挥发性物质9 种。其中BYT、LM5H、XCZD、QT、XDJB、YHM、YHSM和GSB样品分别检测到49、46、46、47、49、47、47 种和53 种挥发性化合物。Zhu Jiancai等[24]研究结果表明己醛、正戊醛、(E)-2-庚烯醛、(E)-2-己烯醛、(E)-2-辛烯醛、(E)-2-壬烯醛、（丙位）γ-癸内酯、（丁位）δ-癸内酯，(R)-(-)-芳樟醇和苯乙醛是桃子中重要的香气活性物质，对桃子的总体香气具有显著的贡献作用。酯类和醇类物质是蟠桃汁和鲜桃中重要的挥发性物质[25-26]，其中GSB样品具有最多的酯类物质（14 种），而YHM具有相对较高的内酯类物质，含量为725.23 µg/kg。

表1 不同品种白桃挥发性化合物组成及含量Table 1 Composition and contents of volatile compounds in eight white-fleshed peach cultivars

图4 不同品种白桃挥发性成分聚类分析热图Fig.4 Heatmap of cluster analysis of volatile components of eight white-fleshed peach cultivars

内酯类物质是桃果实的关键香气成分，赋予桃果实“桃味”特征，是桃香气的主要贡献物质[27]，其中δ-癸内酯、γ-己内酯和γ-癸内酯是桃果实中重要的香气化合物[28]，在本研究中，这3 种内酯类化合物也是8 种白桃共有的特征性香气成分。YHM具有相对较高的γ-癸内酯和δ-癸内酯，含量分别为340.98 µg/kg和135.72 µg/kg，GSB拥有相对较高含量的γ-己内酯（354.54 µg/kg）。

酯类物质是桃子中果香型香气属性的主要来源[29]。乙酸己酯是8 种白桃样品共有的酯类香气化合物，但是其含量因白桃品种不同而存在较大的差异，这可能与不同品种白桃中脂肪酸代谢途径中的关键酶的活性有关[28]。BYT和QT的乙酸己酯含量明显高于其他白桃样品，分别为762.38 µg/kg和640.52 µg/kg，GSB样品中含有相对较多的酯类香气化合物种类，为8 种。

呈青草型香味的醇类、醛类是桃果实中主要的芳香挥发物质[29]。不同品种白桃的醛类和醇类种类及含量相差较大，其中BYT具有最多的醛类物质（13 种），GSB具有最少的醛类物质（7 种），己醛在8 种白桃中含量分布在484.53（LM5H）～9 796.14（XDJB） µg/kg。GSB和XCZD中具有最多和最少的醇类物质，分别为17 种和10 种。YHM中芳樟醇含量最高，为3 605.28 µg/kg；LM5H具有最低含量的芳樟醇，为9.91 µg/kg。

检测出的挥发性成分进行PCA，见图5。PC1的贡献率为67.50%，PC2的贡献率为12.80%，二者累计贡献率为80.30%，基本涵盖8 种白桃样品的基本信息。由图4可知，QT和BYT远离其他样品，说明QT和BYT样品与其他样品存在明显差异。8 种白桃之间没有明显的重叠现象，表明通过GC-MS分析很好区分不同样品之间挥发性成分的差异。GSB和XCZD之间距离较近，说明GSB和XCZD样品之间挥发性成分具有高度相似性，这与电子鼻PCA结果一致。桃果实呈现的总体香气不是单一香气物质作用的结果，而是由众多挥发性成分之间、挥发性成分与非挥发性成分之间相互作用的结果[30-31]，这说明8 种白桃电子鼻PCA结果（图2）与GC-MS分析的挥发性成分PCA结果（图5）具有相似性和差异性。

图5 8 种白桃中挥发性成分的PCAFig.5 PCA of volatile components in eight white-fleshed peach cultivars

2.3 ROAV分析

将OAV最大的香气成分的ROAV定义为100。当某香气成分的ROAV≥1，说明其对样品总体香气具有贡献作用，是关键香气化合物；当ROAV在0.1～1之间时，说明该香气成分对样品总体香气具有修饰作用[32]。

ROAV的计算是基于香气成分的含量及其在水中的感觉阈值共同作用的结果，能够客观评价8 种白桃挥发性成分的差异。经过ROAV分析，8 种白桃样品中共鉴定出25 种对白桃总体香气起到贡献作用的挥发性成分，其中包含内酯类2 种、酯类3 种、醛类10 种、醇类4 种、酮类4 种、其他类2 种，结果见表2。电子鼻结果中W2W传感器响应代表对芳香成分与有机硫化物响应，GSB具有最少的关键香气成分，为13 种，且在电子鼻中W2W的响应值最低，二者结果保持一致，这说明关键香气成分的呈现与电子鼻传感器的响应相对应。

表2 8 种白桃中ROAV≥1的挥发性成分Table 2 Volatile components with ROAV ≥ 1 in eight white-fleshed peach cultivars

由图6可知，醛类物质在各白桃样品中种类数存在明显差异，极差为15%（GSB最少，为18%；QT占比最多，为33%）。内酯类物质和醇类物质种类分布差异次之，含有较多内酯类物质和醇类物质的样品均为GSB，占比分别为18%和38%；含有较少内酯类物质和醇类物质的样品分别为QT和XCZD，占比分别为6%和26%。醛类物质和醇类物质是8 种白桃中种类较多、含量较高的挥发性化合物。

图6 不同品种白桃挥发性物质种类分布百分比图Fig.6 Distribution of volatile species in eight white-fleshed peach cultivars

基于ROAV进一步分析8 种白桃样品总体香气差异的来源，将8 种白桃样品特有和共有的挥发性成分进行分析，见图7。结合图4和图7结果发现8 种白桃共有13 种香气化合物，分别为己醛、反式-2-己烯醛、乙酸反式-2-己烯酯、2-乙基己醇、芳樟醇、(E,E)-2,4-己二烯醛、(E,E)-2,4-庚二烯醛、1-辛烯-3-醇、苯甲醛、反式-2-己烯-1-醇、叶醇、γ-己内酯和γ-癸内酯。各白桃含有0～4 种特有香气物质，这说明8 种白桃中香气成分的浓度是造成不同品种白桃总体香气存在差异的主要来源，与图6结果一致。

图7 不同品种白桃挥发性物质Venn图Fig.7 Venn diagram of volatile species in eight white-fleshed peach cultivars

已知VIP评分用于突出对不同样品聚类有贡献作用的最具有区别性的特征[33]。为进一步筛选引起不同品种白桃总体香气差异的来源，对ROAV≥1的挥发性成分进行VIP评分，见图8。根据VIP评分结果，得出己醛、反式-2-己烯-1-醇、芳樟醇、正己醇、2-己烯醛和反式-2-己烯醛是VIP值大于1的关键挥发性物质，它们的浓度对于区分8 种白桃样品具有重要的作用。

图8 不同品种白桃挥发性物质VIP图Fig.8 VIP values of volatile components in eight white-fleshed peach cultivars

基于VIP值大于1的分析结果，研究己醛、反式-2-己烯-1-醇、芳樟醇、正己醇、2-己烯醛和反式-2-己烯醛在8 种白桃中的分布情况。由图9可知，ROAV≥1且VIP＞1的具有“青草味”的2-己烯醛、己醛、反式-2-己烯醛与反式-2-己烯-1-醇、“花香味”的芳樟醇和“果香味”的正己醇的ROAV在8 种白桃中呈现显著性差异（由Sankey图连线粗细判别），结果说明8 种白桃关键香气的差异与己醛、反式-2-己烯-1-醇、芳樟醇、正己醇、2-己烯醛和反式-2-己烯醛的浓度有关。

图9 不同品种白桃VIP值大于1挥发性物质Sankey图Fig.9 Sankey diagram of volatile compounds with VIP > 1 in eight white-fleshed peach cultivars

3 结 论

采用电子鼻结合HS-SPME-GC-MS开展了8 种白桃的总体香气评价研究，电子鼻及HS-SPME-GC-MS的PCA结果均表明8 种白桃之间的总体香气存在差异，电子鼻的雷达指纹图表明不同品种白桃对W1W、W5S、W1S、W2W传感器的响应存在差异；通过GC-MS共检测出100 种挥发性成分，包括醛类、醇类、内酯类和酯类物质等，基于ROAV≥1且VIP＞1分析鉴定白桃中关键化合物为青草属性的2-己烯醛、己醛、反式-2-己烯醛与反式-2-己烯-1-醇、花香属性的芳樟醇和果香属性的正己醇，它们的浓度造成8 种白桃香气属性的差异，进而引起8 种白桃总体香气的差异。