基于UPLC-MS非靶向代谢组学分析乳杆菌发酵方竹笋超细全浆的代谢差异

王 磊，贾玉龙*，罗彦玉，邹春霞，张 莹

（贵州大学酿酒与食品工程学院，贵州 贵阳 550025）

方竹笋因含丰富的营养成分而备受人们喜爱，但其含大量水分存在不易贮藏的缺点，针对此可采用干制、灌装和发酵等主要的加工形式解决。其中发酵最为常用，可分为自然发酵和接种发酵，自然发酵的产品容易出现问题，产品质量无法控制，而接种发酵既可以缩短发酵周期又可以保证质量[1]。已有的研究表明乳杆菌属，乳球菌属，魏斯氏菌属是竹笋发酵过程的主要优势菌群[2]，而植物乳杆菌是发酵竹笋制品的主要乳酸菌株，能保持竹笋的质构并且产生特殊的风味还能抑制病原菌的生长[3]。接种发酵竹笋常用的乳杆菌多来源于植物[4]，而来源于人的乳杆菌也是一类重要的益生菌，但鲜见其发酵竹笋的相关研究。人源罗伊氏乳杆菌（Limosilactobacillus reuteri）被证明有调节肠道菌群[5]、增加机体免疫[6]等功效，现常用于乳制品和保健食品的研发[7]等。实验室前期研究发现薏苡仁酶解产物能显著促进人源罗伊氏乳杆菌的生长，同时其发酵薏苡仁和牛奶混合物能调节高脂饮食小鼠的脂代谢紊乱[8]。此外罗伊氏乳杆菌是异型发酵菌种，有研究表明异型发酵菌种能快速启动竹笋发酵[9]，同时改善同型乳酸菌发酵竹笋的过酸和不易贮存的问题[10]，故本实验选用罗伊氏乳杆菌发酵方竹笋超细全浆。

此外，考虑到不同形状的竹笋发酵后产品品质不同，前处理的差异也会影响发酵周期和风味。周金沙等[11]研究表明丝状酸笋中益生菌属的相对丰度高于块状。李梅等[12]研究不同处理下毛竹笋的品质变化，发现烫漂乳酸菌发酵能效保持竹笋的质构特性。所以本研究利用湿法超细粉碎技术处理方竹笋，得到的全浆更易发酵。湿法超细粉碎利用超高的剪切力对物料进行剪切摩擦和撞击等作用，可使物料具有更好的溶解性、分散性[13]，其已用于豆浆[14]、鸡骨泥[15]和大蒜[16]等研究。

非靶向代谢组学是利用液相色谱-质谱（liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS）联用、气相色谱-质谱（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）联用等技术对样本内分子质量小于1 000 Da的化合物进行检测，筛选差异代谢物进行代谢通路的富集分析[17]，其常用于研究发酵前后的代谢差异物。张妍等[18]研究了2 种乳酸菌发酵玉米及其副产物的主要代谢成分是1-羟基-2-萘甲酸、儿茶素等有明显生物活性的物质，并富集到5 条显著的代谢通路。Huang Pan等[19]研究发现以植物乳杆菌CCFM8610为发酵剂的乳制品中关键代谢物主要是苯甲酸、6-羟基己酸、D-苯基乳酸、马尿酸等。但非靶向代谢组学在方竹笋发酵方面鲜有报道。为了解乳杆菌发酵方竹笋超细全浆的主要代谢物质和代谢通路，本研究用2 种乳杆菌单一和混合发酵方竹笋超细全浆，运用超高效液相色谱-质谱（ultra-high performance liquid chromatography-mass spectrometry，UPLC-MS）非靶向代谢组学技术结合多元统计方法对发酵前后的差异代谢物进行对比，同时用京都基因和基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）数据库进行代谢通路富集分析。探究植物乳杆菌和罗伊氏乳杆菌发酵的特征代谢，以期为方竹笋超细全浆发酵的开发和应用提供实际参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

方竹笋：2021年9月采于贵州遵义桐梓县未脱壳，4 h内运回实验室，放置在-20 ℃冰箱待用。罗伊氏乳杆菌（保藏号BNCC 186563）、植物乳杆菌（保藏号BNCC 194165） 北京北纳创联生物技术研究院。

甲醇（色谱级） 美国赛默飞世尔科技有限公司。

1.2 仪器与设备

Q ExactiveTMHF质谱仪、Vanquish UHPLC色谱仪、Hypesil Gold色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.9 μm） 德国Thermo Fisher公司；D3024R低温离心机 美国Scilogex公司；H2-16KR型台式离心机 湖南可成仪器设备有限公司：SW-CJ-2D超净工作台 浙江苏净净化公司；scientz-18N型冷冻干燥机 宁波新芝生物技术有限公司；LDZE-75KB-II高压灭菌锅 上海申安医疗机械厂；QDWZ3000-18D/QDGX-18型湿法超微粉碎机无锡轻大食品装备有限公司；JR-200型高速粉碎机东莞市新美华机电设备有限公司。

1.3 方法

1.3.1 发酵方竹笋超细全浆的制备

方竹笋去壳洗净、切块，笋与水按2∶1（g/mL）比例混合，粗粉碎4 min，细粉碎1 次（样品温度35 ℃），冷却分装，-20 ℃保存。罗伊氏乳杆菌和植物乳杆菌活化后，单菌落接于MRS液体培养基中37 ℃培养到菌浓度为107CFU/mL[20-21]。100 g超细粉，105 ℃灭菌20 min，冷却后加入5%的种子液，37 ℃发酵48 h。发酵后样品冷冻干燥48 h，粉碎过100 目，4 ℃保藏。其中，混菌发酵组比例1∶1。非发酵组记为CK、罗伊氏乳杆菌发酵组记为LR、植物乳杆菌发酵组记为LP、混菌发酵组记为LRP。

1.3.2 基本组成及指标测定

蛋白质含量：参考GB 5009.5—2016《食品中蛋白质的测定》凯氏定氮法测定；脂肪含量：参照GB 5009.6—2016《食品中脂肪测定》索氏抽提法测定；膳食纤维含量：参照GB 5009.88—2014《食品中膳食纤维的测定》；灰分含量：参照GB 5009.4—2016《食品中灰分测定》；pH值使用pH计测定；可滴定酸测定参考杨维维[22]的方法。

1.3.3 代谢物提取

将2 g样品加入液氮粉碎，取100 mg的组织样本，放入EP管中，加入500 μL的80%甲醇溶液并充分混匀。将混合物置于冰水浴中5 min，在15 000×g、4 ℃离心20 min，取上清液，用质谱级水稀释至甲醇体积分数为53%，15 000×g、4 ℃离心20 min，取上清液，进样进行LC-MS分析[23]。从每个实验样品中取等体积样品，混匀制成QC样品；53%甲醇溶液代替实验样品作为空白样品，前处理过程与实验样品相同。

1.3.4 LC-MS条件

LC条件：Hypesil Gold色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.9 μm）；柱温40 ℃，流速0.2 mL/min。正离子模式下：流动相A为0.1%甲酸，流动相B为甲醇；负离子模式：流动相A为5 mmol/L醋酸铵（pH 9.0），流动相B为甲醇。正、负离子模式下色谱梯度洗脱程序见表1。

表1 色谱梯度洗脱条件Table 1 Chromatographic gradient elution procedure

MS条件：质量扫描范围m/z100～1 500；电喷雾离子源；电压3.5 kV；鞘气流速35 L/min；辅助气流速率10 L/min；离子传输管温度320 ℃；离子导入射频电平为60 V；辅助气加热器温350 ℃；极性为正极和负极；MS/MS二级扫描为数据依赖性扫描。

1.4 数据处理与分析

将下机数据（.raw）文件导入CD3.1搜库软件中进行处理，与mzCloud、mzVault和Masslist数据库进行比对，对原始定量结果进行标准化处理，最后得到代谢物的鉴定结果和相对定量值。

代谢物使用KEGG数据库（http://www.genome.jp/kegg/pathway.html）、人类代谢组数据库（Human Metabolome Database，HMDB）（http://hmdb.ca/metabolites）和脂质代谢途径研究计划（Lipid metabolites and pathways strategy，LipidMaps）数据库（http://www.lipidmaps.org/）注释。使用t检验计算统计学意义（P值）。差异代谢物采用多变量偏最小二乘判别分析模型的变量投影重要性（variable importance in projection，VIP）值，结合P值以及单变量差异倍数（fold change，FC）进行筛选。

正交偏最小二乘判别分析（orthogonal partial least squares-discriminant analysis，OPLS-DA）使用SIMCA14.1软件。主成分分析（principal component analysis，PCA）用Metaboanalst（http://www.metaboanalyst.ca），将数据归一化为Z分数进行聚类热图制作。火山图基于log2FC和-lgP对上调与下调的代谢物进行筛选，采用GraphPad Prism 9.4.0进行图形绘制。得到的KEGG通路具有P＜0.05、且过表达分析（overrepresentation analysis，ORA）被认为是有统计学意义的富集通路。数据处理采用SPSS 25.0软件，结果表示为±s，样品3 个平行，显著性P＜0.05。

2 结果与分析

2.1 基本营养成分分析

如表2所示，发酵后的方竹笋超细全浆pH值从6.26降到4.77、4.16和4.20；可滴定酸质量分数从0.13%增加到0.34%、0.49%和0.53%。可滴定酸的含量不同可能是因为罗伊氏乳杆菌是异型发酵，而植物乳杆菌是同型发酵（发酵产生的乳酸较多）。而粗蛋白含量LRP组高于其他组可能是因为增加了菌体蛋白所引起[24]或是发酵产生了更多的含氮类似物所引起[25]。此外总膳食纤维含量减少可能是因为乳杆菌的生长代谢消耗了部分膳食纤维。

表2 乳杆菌发酵竹笋超细全浆的基本营养成分Table 2 Basic nutritional composition of Lactobacillus-fermented ultra-fine whole pulp of bamboo shoot

2.2 UPLC-MS检测

如图1所示，在4～12 min检测到的代谢物最多。如图2所示，正离子和负离子模式下QC样本相关性均大于0.992，而QC样本相关性越高（R2越接近于1）说明整个检测过程稳定性越好，说明在质谱检测的过程中，样品的均一度较好。

图1 QC样本与样品的总离子流图谱Fig.1 Total ion current chromatograms of QC samples and bamboo shoot samples

图2 非靶向代谢样本QC的Pearson相关性图Fig.2 Pearson correlation coefficients of metabolites in QC samples analyzed in the positive and negative ion modes

2.3 代谢产物的PCA

使用MetaX软件[26]对数据进行对数转换及标准化处理。从表3可知，正离子模式下检测出的代谢产物有948 种，负离子模式下检测出的代谢产物有586 种，将代谢产物与KEGG、HMDB和LipidMaps数据库对比，共检测到正离子模式下有293、490 种和103 种；负离子模式下为192、313 种和92 种。将代谢产物进行PCA，从图3可知，正离子模式下PC1、PC2分别为47.5%、17.0%；负离子模式下PC1、PC2分别为53.33%、21.5%。CK与LR，LP和LRP组分开较远，组间明显分离说明各组之间存在显著差异，而各组间样品相差不远说明组内差异不明显。

图3 乳杆菌发酵竹笋超细全浆代谢物PCA图Fig.3 Principal component analysis plots of metabolites in Lactobacillus-fermented bamboo shoot ultra-fine whole pulp

表3 乳杆菌发酵竹笋超细全浆代谢物的统计Table 3 Statistics of metabolites in Lactobacillus-fermented bamboo shoot ultra-fine whole pulp

2.4 代谢物的OPLS-DA

当变量数量大于样本个数时，使用PLS-DA所得到的模型会出现过拟合现象，而加入正交矫正后数据检测出假阳性的概率会降低，使数据更准确。本实验建立的OPLS-DA模型中R2Y和Q2都接近于1，说明模型可靠[27]。如图4所示，LR、LP和LRP、CK组分离较好，说明各组之间存在显著差异；OPLS-DA置换检验见图5，置换图反映模型是否出现过拟合的现象，其结果显示正离子和负离子模式下，各实验组中Q2与纵轴的交点为负值，说明模型不存在过拟合。

图4 乳杆菌发酵竹笋超细全浆代谢产物的OPLS-DA得分图Fig.4 OPLS-DA scores of metabolites of Lactobacillus-fermented bamboo shoot ultra-fine whole pulp

图5 乳杆菌发酵竹笋超细全浆代谢产物的OPLS-DA置换检验Fig.5 Permutation test of OPLS-DA model for metabolites in Lactobacillus-fermented bamboo shoot ultra-fine whole pulp

2.5 代谢产物的火山图分析

将代谢产物进行单因素t检验并结合综合变异系数法可得两组的差异化合物，且能清晰看出差异代谢物在组间是上调还是下调，其筛选条件为P＜0.05，log2FC＞1或log2FC＜-1。由图6可知，正离子模式下CK和LR组中共筛选出差异代谢物361 种，上调178 种、下调183 种；CK和LP组中差异化合物有392 种，上调192 种、下调200 种；CK和LRP组中差异代谢物398 种，上调192 种、下调206 种；负离子模式下CK和LR组差异代谢物有268 种，上调144 种、下调124 种，CK和LP组筛选的差异化合物有304 种，上调162 种、下调142 种，CK和LRP组共筛选的差异代谢化合物有321 种，上调177 种、下调144 种。

图6 乳杆菌发酵竹笋超细全浆代谢产物的火山图Fig.6 Volcano maps of metabolites in Lactobacillus-fermented bamboo shoot ultra-fine whole pulp

2.6 差异代谢物的筛选、分类和鉴定

采用多维统计VIP值大于1和单变量统计P＜0.05，log2FC＞1或log2FC＜-1进行差异代谢物的筛选。如图7所示，从Super Class分类上看，CK vs.LP组中脂类和类似脂类分子占26.44%，有机酸及其衍生物占16.11%，有机杂环化合物占16.41%，苯类占10.94%，苯丙烷和聚酮类占10.03%；CK vs.LR组中脂类和类脂类分子占27.00%，有机酸及其衍生物占17.67%，有机杂环化合物占16.00%，苯类占9.00%，苯丙烷和聚酮类占12.67%；CK vs.LRP组中脂类和类脂类分子占25.66%，有机酸及其衍生物占17.11%，有机杂环化合物占16.22%，苯类占10.62%，苯丙烷和聚酮类占10.91%。

图7 乳杆菌发酵竹笋超细全浆差异代谢产物的类别Fig.7 Categories of differential metabolites in Lactobacillus-fermented bamboo shoot ultrafine whole pulp

将代谢物与库（mzCloud Re sults、m z Va ul t Results、MassList Results）进行匹配，并将库设置为full match[28]，选择差异物绘制热图（图8）。选择FC（FC值大，上调越显著；FC值小，下调越显著）进行物质描述，正离子模式下，CK vs.LR组上调的主要差异化合物为组胺（FC=222.42）、胸腺嘧啶和脯氨酸等，下调的为组氨酸和腺苷（FC=0.001）等；CK vs.LP组上调的主要差异化合物为甲基腺苷（FC=30.78），植物鞘氨醇和香芹酮等，下调的为S-腺苷同型半胱氨酸（FC=0.02）和氧化苦参碱等；CK vs.LRP组上调的主要差异化合物为组胺（FC=163.07）、N6-甲基腺嘌呤和鸟氨酸等，下调的主要化合物有腺苷（FC=0.002）和胞苷等。由上述可知，核苷酸和氨基酸物质是组间差异最显著的物质种类。核苷类化合物是维持生物细胞正常生命活动物质，具有抗癫痫、抗肿瘤和抗心率失调等多种功能，近几年，竹笋中的核苷类化合物也被鉴定出[29-30]。氨基酸类如鸟氨酸、脯氨酸和组氨酸等，乳酸菌发酵会使精氨酸通过细胞内精氨酸脱亚胺酶途径产生鸟氨酸[31]。此外，在LR组中FC最大是组胺，罗伊氏乳杆菌可以将L-组氨酸转换为组胺，它是一种有机含氮化合物，能修复肠黏膜增强肠道的屏障功能[31-33]。同时Alan等[34]研究发现从泡菜里筛选的植物乳杆菌会产生组胺但不在毒性范围。综上，正离子模式下，罗伊氏乳杆菌和植物乳杆菌发酵方竹笋超细全浆会产生组胺、核苷酸（甲基腺苷、7-甲基鸟苷等）和氨基酸（鸟氨酸、脯氨酸等）类物质。

图8 乳杆菌发酵竹笋超细全浆差异代谢产物的聚类热图Fig.8 Cluster heatmap of differential metabolites in Lactobacillusfermented bamboo shoot ultra-fine whole pulp

负离子模式下，CK vs.LR组上调的差异化合物为D-甘露糖醇（FC=379.28）、吲哚-3-乳酸、N-乙酰甘氨酸等，下调的为鸟苷（FC=0.001）和尿苷酸等；CK vs.LP组上调的差异化合物吲哚-3-乳酸（FC=376.87）、DL-4-羟基苯乳酸和反式肉桂酸，下调的有柠檬酸（FC=0.004）和苹果酸等；CK vs.LRP组中上调的化合物主要有吲哚-3-乳酸（FC=335.80）、DL-4-羟基苯乳酸和反式肉桂酸等，下调的主要有柠檬酸（FC=0.005）和鸟嘌呤核苷等。负离子模式下检测的主要为有机酸及其衍生物类物质，其中吲哚-3-乳酸在各组中是明显上调的物质。吲哚-3-乳酸是一种带吲哚环的色氨酸代谢产物，不仅具有抗氧化活性和免疫调节作用，而且对糖尿病和炎症型肠道疾病有明显的作用[35]。Zhao Yansheng等[36]利用UPLC-HMRS的方法研究植物乳杆菌dy-1发酵大麦提物的代谢物，发现吲哚-3-乳酸、苯乳酸和咖啡醇等物质在发酵后含量明显增加。4-羟基苯乳酸是苯乳酸的羟基衍生物，研究发现，其与苯乳酸一样有很好的抑菌效果[37]。沐万孟等[38]用HPLC检测乳杆菌SK007发酵液中4-羟基苯乳酸的最大质量浓度为75 μg/mL。除了上述的差异代谢物外，D-甘露糖醇是罗伊氏菌发酵产生的FC最大的物质。D-甘露糖醇是多元醇，具有抑制肿瘤保护肝脏等作用[39]；且有研究表明罗伊氏乳杆菌发酵薏苡仁会产生D-甘露糖醇[21]。负离子模式下，罗伊氏乳杆菌和植物乳杆菌发酵方竹笋超细全浆能产生吲哚-3-乳酸、D-甘露糖醇、DL-4-羟基苯乳酸等生物活性作用的物质。

2.7 代谢差异物的分类和功能注释

将组间有KEGG ID的差异代谢物与KEGG数据库进行匹配，获得差异代谢物参与通路，对富集分析得到差异物较多的通路进行分析。图9显示了差异代谢物富集的通路，颜色深浅代表通路的重要性。正离子模式下，各组间富集到的代谢通路有所不同，但其主要的代谢通路为嘧啶代谢、嘌呤代谢、谷胱甘肽代谢、甘油磷脂的代谢、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸的代谢、β-丙氨酸的代谢、VB6的代谢、组氨酸代谢、苯丙氨酸代谢和核黄素代谢等。负离子模式下，主要的代谢通路为柠檬酸循环、苯丙氨酸代谢、嘧啶代谢，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸的代谢，缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的生物合成，酪氨酸和色氨酸生物合成及酪氨酸代谢等。

差异代谢物在某个通路中显著富集，但仍不知道这些代谢物在这个代谢通路中是否起到关键作用，代谢物对代谢通路究竟有多大影响，拓扑分析可以计算关注的代谢物在代谢通路中的作用大小（用影响因子衡量）[40]。图10为拓扑分析结果虚线右侧表明代谢通路越重要，结果表明，正离子模式下，CK vs.LR组中嘌呤代谢和嘧啶代谢是显著的通路，CK vs.LP组和CK vs.LRP组中嘧啶代谢是显著的通路；负离子模式下，各组中柠檬酸循环、苯丙氨酸代谢和嘧啶代谢是显著的通路。从表4、5可以看出，嘌呤代谢主要参与的代谢物为鸟嘌呤、腺苷和2’-脱氧鸟苷等；胸腺嘧啶、胞嘧啶和胞苷等是嘧啶的代谢主要差异物；柠檬酸、富马酸和异柠檬酸是柠檬酸循环的主要差异物；苯丙氨酸代谢中主要差异物质为苯甲酸、苯乙醛和反式肉桂酸等。

图10 乳杆菌发酵竹笋超细全浆差异代谢产物显著富集的代谢通路拓扑分析Fig.10 Topological analysis of significantly enriched metabolic pathways for differential metabolites of Lactobacillus-fermented bamboo shoot ultra-fine whole pulp

表4 正离子模式下乳杆菌发酵竹笋超细全浆富集到KEGG通路中差异化合物Table 4 KEGG pathway enrichment of differential compounds in Lactobacillus-fermented bamboo shoot ultrafine whole pulp in the positive ion mode

表5 负离子模式下乳杆菌发酵竹笋超细全浆富集到KEGG通路中差异化合物Table 5 KEGG pathway enrichment of differential compounds in Lactobacillus-fermented bamboo shoot ultrafine whole pulp in the negative ion mode

有研究表明，有降解嘌呤能力的乳杆菌中就包括罗伊氏乳杆菌和植物乳杆菌[41]，所以这两株菌发酵方竹笋后能下调其嘌呤的含量。嘧啶类化合物是构成细胞中核糖核酸和脱氧核糖核酸的重要组成，而且许多嘧啶类药物被证明有抗肿瘤活性[42]；嘧啶代谢往往会与氨基酸代谢联系，如5-甲基胞嘧啶和胸腺嘧啶会参与缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸降解。柠檬酸循环是生物体内糖类、蛋白质、脂肪等营养物质供能的重要途经。张妍等[18]研究了2 种乳酸菌发酵饮料并用非靶向代谢组学手段研究其差异代谢物与相关代谢通路，结果发现，柠檬酸循环是较为显著的代谢通路。苯丙氨酸是人体所必需的氨基酸，人体不能合成只能从外界摄取，苯丙氨酸分解产生的酪氨酸不仅可以参与甲状腺激素的合成，还可以被分解为富马酸和乙酰乙酸，参与其他的生物途径[43]。乳酸菌可以利用苯丙氨酸生成苯乳酸即苯丙氨酸通过转氨反应生成苯丙酮酸，苯丙酮酸会提高苯乳酸的产量[44]。KEGG分析表明，罗伊氏乳杆菌和植物乳杆菌中富集到的嘌呤代谢途径下调方竹笋超细全浆中的嘌呤含量，柠檬酸循环会产生更多的有机酸和风味物质，从而提升方竹笋超细全浆的品质。

3 结 论

用罗伊氏乳杆菌和植物乳杆菌单一和混合发酵方竹笋超细全浆，利用非靶向代谢组学技术结合多元分析手段研究差异代谢物与代谢通路。以VIP值大于1，P值小于0.05为筛选标准进行筛选，结果表明，各组中显著的差异代谢物主要为脂类和类似脂类分子、有机酸及其衍生物、有机杂环类化合物、苯类、苯基丙酸类和聚酮类化合物；将代谢物与库（mzCloud Results、mzVault Results、MassList Results）进行匹配发现正离子模式下差异代谢物主要为组胺、甲基腺苷、鸟氨酸和脯氨酸等，负离子模式下差异代谢物主要为D-甘露糖醇、吲哚-3-乳酸和DL-4-羟基苯乳酸等。差异代谢物所富集到代谢途径表明，嘌呤代谢、嘧啶代谢、柠檬酸循环和苯丙氨酸代谢是较显著的通路。乳杆菌发酵方竹笋超细全浆会通过上述代谢通路产生核苷酸和有机酸等代谢产物，会赋予其更多的风味和营养。综上，通过对乳杆菌发酵方竹笋超细全浆的代谢产物分析，探究了其差异代谢产物与代谢途径，为乳杆菌发酵方竹笋超细全浆的进一步研究提供理论参考。