仙茅有效成分含量与土壤因子相关性研究

王树生，杨军文，邓重梨，张金渝，杨美权，邓国宾*

（1.西南林业大学 生物多样性保护学院，云南 昆明 650224； 2.云南省农业科学院 药用植物研究所，云南 昆明 650205）

仙 茅（Curculigo orchioidesGaertn）为 石 蒜 科（Amaryllidaceae） 草本植物，分布于我国四川和云南等地，是我国传统药用植物之一。仙茅常以其根茎入药，用于肾虚阳痿、滑精遗精、精冷不育、腰膝冷痛、寒湿痹痛、尿频遗尿等症状的治疗［1-2］。现代药理研究表明，仙茅主要化学成分有酚类、酚苷类、木脂素类、三萜皂苷类、黄酮类、生物碱类等［3］，具有抗氧化、抗炎症、调节免疫和抗骨质疏松等作用［4］。近年来，仙茅已经逐渐被开发为各种临床用药和保健品，这使得野生仙茅资源面临枯竭。人工栽培代替野生药材已成发展趋势，但盲目的人工栽培导致其品质参差不齐、质量稳定性差，难以满足药材内在质量的要求。因此，如何在满足市场需求的同时保证仙茅药材的质量成为仙茅药材栽培的重要任务。研究表明，中药材品质主要与遗传因素和生长环境有关。药用植物中有效成分的形成与积累受环境因素的影响较大，除了受气候季节变化的影响外，还受土壤中矿物质种类和土壤肥力等因素的影响。环境因素是中药材形成道地性的重要原因，影响药材的生长发育和次生代谢物质的积累，对药材质量有重要影响［5-7］。Lang 等研究表明，阿勒泰地区3 种典型的药用多年生草本植物甘草、大黄、泽泻与土壤中的氮、磷、钾以及有机质等存在不同程度相关性［8］。Yuan等研究发现，土壤pH、全氮、全磷和有效磷是影响栽培铁皮石斛主要药用品质的关键因子［9］。因此，明确土壤因子与仙茅药材质量之间关系，是揭示药材有效成分成因和提高品质的关键［10-11］。

近年来，对仙茅的研究多集中在化学成分分析和药理作用等方面［12-13］，鲜见关于其有效成分含量与土壤因子相关性的研究报道。鉴于此，本研究以20 个野生种群仙茅及其根际土壤为实验材料，分析了旨在为仙茅科学种植、品质提升和药用价值保护提供理论支撑。

1 材料与方法

1.1 材料

2021年9月于仙茅采收期在云南文山、临沧、西双版纳和四川宜宾采集20 个野生种群仙茅根茎及其根际土壤样品。每个种群采集5株长势较为均一且健康的仙茅根茎，采样时先去除土壤表层的腐殖质及枯枝落叶层，挖取完整的仙茅根茎，采用抖根法收集根际土壤，将土壤样品等量混合，混合后的土壤样品和根茎样品分别装入无菌塑封袋内。仙茅根茎经云南省农业科学院药用植物研究所张金渝研究员鉴定为石蒜科仙茅属植物仙茅的根茎。把样品带回实验室，土壤样品自然风干后研磨过筛，密封保存，用于理化性质测定；仙茅根茎经蒸馏水洗净后自然风干，称取质量，粉碎后密封保存备用。其他信息详见表1。

表1 采样信息Tab.1 Geographic of the sample acquisition information

1.2 方法

1.2.1 仪器与试剂

U3000 型Thermo 高效液相色谱仪［赛默飞世尔（中国）有限公司］；SP-7560 型紫外分光光度计（上海光谱仪器有限公司）；LXJ-IIB 型离心机（上海安亭科学仪器厂）；AU-S2 型纯水机（四川科瑞峰环境科技有限公司）；PHS-3C 型pH 计（上海仪电科学仪器股份有限公司）；FP6140型火焰光度计（上海仪电分析仪器有限公司）；WFX-1308型原子吸收分光光度计（北京瑞利分析仪器有限公司）；K9840 型凯氏定氮仪（济南海能未来技术集团股份有限公司）；KQ-500DE 型超声仪（昆山市超声仪器有限公司）；BSA224S-CW 型分析天平［赛多利斯科学仪器（北京）有限公司］；HH-S8 型数显恒温水浴锅（江苏金怡仪器科技有限公司）；HY-1 型涡旋仪（上海仪电科学仪器股份有限公司）；0.45 μm 微孔滤膜过滤器（天津市腾达过滤器件网）。

试剂：无水乙醇为优级纯，乙腈和甲醇均为色谱纯，以上试剂均购自陇西化工；纯水为实验室自制。芦丁（批号：MUST-21011510，成都曼斯特生物科技有限公司；纯度≥98%），没食子酸（批号：21080585，坛墨质检标准物质中心；纯度≥98%），仙茅苷（批号：B21352，上海源叶生物科技有限公司；纯度≥9%）。

1.2.2 仙茅有效成分含量测定

按照《中国药典》2020 版（一部）仙茅项下的高效液相色谱法对仙茅苷进行测定，色谱条件：C18（5 μm × 4.6 mm × 250 mm），以乙腈-0.1%磷酸溶液（21∶79）为流动相，检测波长为285 nm，理论板数按仙茅苷峰计算应不低于3 000［2］；总黄酮［14］和总多酚［15］均采用紫外分光光度计法进行测定。每个样品进行2次重复。

1.2.3 土壤因子含量测定

参照《土壤农化分析方法》［16］测定土壤样品中的pH 值、有机质、全钾、速效钾、缓效钾、全氮、碱解氮、全磷、有效磷、交换性钙和交换性镁，以上每个样品进行3次重复。

1.3 数据处理

运用Excel 2010 进行数据录入和整理，分别采用SPSS 23.0、 DPS 7.05 和Origin 2018 统计分析软件对数据进行相关性分析、灰色关联度分析、聚类分析以及图形绘制。

2 结果与分析

2.1 仙茅有效成分含量分析

依据1.2.2 所述方法对20 个不同居群仙茅样本中仙茅苷、总黄酮和总多酚等有效成分含量进行测定，其结果见表2。

表2 仙茅有效成分含量测定Tab.2 The determination of the content of active ingredients in C.orchioides

通过对20 个不同居群仙茅有效成分的含量测定发现（表2），仙茅苷、总黄酮、总多酚3种有效成分含量均存在一定差异（P＜0.05），且不同成分间的差异程度也不同。所有样品的仙茅苷含量均符合2020 年版《中国药典》标准（不少于0.10%），其含量在0.10% ～ 0.37%之间，平均值为0.25%，其中YWS-02 样品中的仙茅苷含量最高，是YBN-01 样品（最低）的3.7倍。总黄酮含量在7.97 ～ 23.01 mg/g之间，平均值为14.61 mg/g，其中SYB-01 样品中的总黄酮含量最高，是YLC-05 样品（最低）的2.89 倍。总多酚含量在5.81 ～ 17.24 mg/g之间，平均值为9.11 mg/g，其中SYB-01 样品中的总多酚含量最高，是YLC-05样品（最低）的2.97 倍。从变异系数来看，各有效成分变异系数为27.77% ～ 36.00%，均处于中等变异范围（10% ～ 100%）内，说明不同居群间仙茅有效成分含量浓度存在一定差异，品质相对不稳定。

2.2 土壤理化性质分析

20 个不同居群仙茅土壤因子含量测定结果见表3。根据全国第二次土壤普查养分分级标准（表4），分析仙茅生长地土壤的养分特征。结果显示：土壤pH 值为3.9 ～ 6.6，平均值为5.01，其中表明所有土壤样品属于酸性土壤。有机质含量为14.10 ～177.76 g/kg，其中YLC-05 样品中的有机质含量最高，是SYB-01 样品（最低）的12.60 倍。参考全国土壤养分含量分级标准，除SYB-05、YBN-02、SYB-02和SYB-01外，大部分居群的土壤有机质含量为1级或2 级标准，属于丰富至极丰富水平。有效磷含量为0.20 ～ 16.30 mg/kg，其中YBN-05 样品中的有效磷含量最高，是YWS-01 样品（最低）的80.50 倍，仅有YBN-05 样本为3 级标准属于中等水平，其余样本均为4 级至6 级标准，属于缺乏至极缺乏水平。全磷含量为0.12 ～ 1.62 g/kg，其中YBN-01样品中的全磷含量最高，是YLC-04 样品（最低）的13.03 倍，大部分样本为3 级或4 级标准，属于中等或缺乏水平。全氮含量为1.22 ～ 163.57 g/kg，其中SYB-03 样品中的全氮含量最高，是YBN-02 样品（最低）的134.40 倍，大部分样本为1 级标准，属于极丰富水平，部分样本为2 级或3 级标准，属于丰富或中等水平。碱解氮含量为0.22 ～ 849.00 mg/kg，其中YLC-01 样品中的碱解氮含量最高，是SYB-01 样品（最低）的3 807.17 倍，除SYB-05、SYB-03、SYB-04、SYB-02 和SYB-01 样本外，其余样本均为1 级至3级标准，属于为中等至极丰富水平。全钾含量为4.90 ～ 47.00 g/kg，其中YBN-01 样品中的全钾含量最高，是YBN-03 样品（最低）的9.59 倍，仅有YBN-03 样本为6 级标准，属于极缺乏水平，其余样本1 级至5 级均有分布，属于缺乏至极丰富水平。速效钾含量为6.33 ～ 228.33 mg/kg，其中YLC-01 样品中的速效钾含量最高，是YBN-03 样品（最低）的36.05倍，YLC-01 样本为1 级标准，属于极丰富水平，YWS-05 和YBN-03 为6 级标准，属于极缺乏水平，其余样本集中在2 级至5 级标准，属于较缺乏至丰富水平。缓效钾含量为23.33 ～ 2 564.00 mg/kg，其中YLC-01 样品中的缓效钾含量最高，是SYB-03 样品（最低）的109.89 倍，YWS-05 和YBN-05 为5 级标准，属于较缺乏水平，YBN-03 和SYB-03 为6 级标准，属于较缺乏水平，其余样本为1 级至四级标准，属于缺乏至极丰富水平。交换性钙含量为158.37 ～1 526.80 mg/kg，其中SYB-01 样品中的交换性钙含量最高，是YLC-04 样品（最低）的9.64 倍；交换性镁含量为0.27 ～ 5.23 mg/kg，其中YLC-01 样本中的交换性镁含量最高，是SYB-01样本（最低）的19.16倍。

表3 各土壤因子含量测定Tab.3 Determination of the content of soil factors

表4 土壤养分含量分级标准Tab.4 Grading standards for soil nutrient content

从变异系数来看，pH 值变异系数为12.86%，变异程度较小。有机质、全磷、全氮、有效磷、碱解氮、全钾、速效钾、缓效钾、交换性钙、交换性镁均有不同程度变异，变异范围为48.90% ～ 170.65%。其中变异程度最大的是全氮，变异系数为170.67%。结果表明，野生仙茅主要分布在略偏酸性土壤，且除pH外，其余土壤指标含量在不同居群及同一居群内均存在显著差异。

2.3 土壤聚类分析

以20 个不同居群仙茅11 个土壤因子含量为变量，采用系统聚类法对居群进行分析（图1），发现当阈值为10 时，20 个不同居群土壤因子可以分为3组：第一类是将 YLC-01 单独聚为一类，第二类为YLC-02、YLC-03、YLC-04、YLC-05，第三类将其余样本分为一类。分析数据发现， YLC-01 样品的碱解氮、速效钾、缓效钾和交换性镁的含量显著高于其他样本，所以单独聚为一类；而YLC-02、YLC-03、YLC-04、YLC-05 样本的有机质、碱解氮、和交换性镁含量较高，全磷和交换性钙含量较低，所以聚为第二类；第三类样本中各土壤因子含量互有高低，而且并无规律所以聚为一类。

图1 土壤因子聚类分析Fig.1 Cluster analysis of soil factors

2.4 土壤因子相关性分析

对11 个土壤因子含量进行Pearson 相关性分析，结果显示（图2），交换性钙与全氮、全钾均呈极显著正相关；缓效钾与速效钾呈极显著正相关；交换性镁与全磷、交换性钙呈极显著负相关，与速效钾、缓效钾呈极显著正相关；有机质与交换性钙呈显著正相关，与交换性镁呈显著负相关；碱解氮与全氮呈显著负相关，与交换性钙呈极显著负相关，与速效钾呈显著正相关，与缓效钾、交换性镁、有机质均呈极显著正相关；pH与全氮呈显著负相关。综上所述，土壤养分之间存在显著或极显著相关性，说明仙茅土壤因子间可能存在着不同程度的促进或抑制作用。

图2 土壤因子相关性Fig.2 Pearson analysis of soil factors

2.5 仙茅有效成分含量和土壤因子灰色关联度分析

利用数据分析软件DPS 7.05 对仙茅有效成分含量与土壤因子进行灰色关联度分析，结果见图3。仙茅有效成分含量与土壤因子的灰色关联值越高，说明这些土壤因子与仙茅的各个有效成分含量关系越密切。

图3 仙茅有效成分含量与土壤因子的灰色关联值Fig.3 Grey correlation value between chemical composition contents and soil factors of C. orchioides

结果显示，影响仙茅苷含量的土壤因子关联度从高到低依次为：海拔＞pH＞速效钾＞有效磷＞全钾＞有机质＞交换性镁＞交换性钙＞全磷＞水解性氮＞缓效钾＞全氮；从总黄酮含量来看：pH＞全磷＞全钾＞交换性钙＞海拔＞缓效钾＞速效钾＞有效磷＞有机质＞水解性氮＞交换性镁＞全氮；从总多酚含量来看：pH＞全磷＞交换性钙＞全钾＞海拔＞有机质＞水解性氮＞速效钾＞缓效钾＞有效磷＞交换性镁＞全氮。综合来看，海拔、pH、全钾、全磷、有机质、交换性钙是影响仙茅有效成分的重要影响因素。

2.6 仙茅有效成分含量和土壤因子相关性分析

为进一步确定影响仙茅有效成分的土壤因子，在灰色关联度分析的基础上，对仙茅的3 个有效成分含量与11 个土壤因子含量进行Pearson 相关性分析。由图4可知，仙茅苷与全磷、交换性钙呈显著负相关，与海拔呈显著正相关（P＜0.05）；总黄酮与有机质呈显著负相关，与全钾呈显著正相关（P＜0.05）；总多酚与土壤因子相关性不显著。研究结果显示，全钾和海拔对促进仙茅有效成分的形成和积累有积极作用，有机质、全磷和交换性钙对仙茅有效成分的形成和积累则是抑制作用。

3 讨论与结论

仙茅的化学成分主要为酚及酚苷类、木脂树及其三苷类、黄酮类、生物碱、多糖等［18］。仙茅根茎中很多化学成分都具有药理活性，如仙茅苷具有抗炎［19］、抗氧化、预防骨质疏松等药理作用［20］；仙茅素A具有一定的补肾壮阳作用［21］；Crassifoside G 等8种酚及酚甘类化合物具有很强的氧化活性［22］；黄酮具有保护心血管、抗氧化、降血糖等多种药理活性［23］。上述成分是仙茅发挥药理作用的有效成分，其含量高低决定了仙茅的品质，探讨其有效成分形成和积累的影响因素对调控其有效含量具有重要价值。

生态因子是影响药材药效成分含量的重要因素，包括气候因子、土壤因子及地理因素等［24］。其中土壤是植物生长发育的基础，土壤的物理、化学性质以及所含的各种元素对药材生长发育及次生代谢物积累均具有重要影响［25］。因此，研究土壤因子对药材质量的影响对于高品质药材的生产具有十分重要的意义。该研究对20 个不同居群仙茅有效成分含量及其土壤因子含量进行测定，并对它们之间的相关性进行了分析，结果显示，不同地区仙茅所生长的土壤呈酸性，该研究结果与前人研究报道一致［26］。土壤中有机质、全氮、碱解氮和缓效钾含量丰度较高，全磷、全钾含量丰度中等，有效磷、速效钾含量丰度较低，且土壤因子之间存在不同程度的相关。聚类分析表明，20 个不同居群土壤被分为3个组，这种结果很有可能是由于经纬度、海拔和气候等因素综合影响，导致各采样点的土壤属性等显现出较大差别。

灰色关联度分析法结果显示，海拔、pH、速效钾、全钾、全磷、交换性钙是影响仙茅有效成分的重要影响因素。相关性分析表明，全钾和海拔对促进仙茅有效成分的形成和积累有积极作用，有机质、全磷和交换性钙对仙茅有效成分的形成和积累则是负作用。在影响仙茅有效成分的多个土壤因子中，钾作为品质元素可显著提升作物的抗性和品质，提高药用植物中黄酮类成分的含量［27］。本研究发现，全钾与总黄酮呈显著正相关，说明钾在仙茅总黄酮的合成和含量累积以及抗逆性方面具有积极作用。土壤中的磷对根的生长发育具有重要的作用［28］，因此对于仙茅根茎的生长发育以及有效成分的合成与累积具有重要影响。有机质和阳离子交换量反映了土壤肥力水平和保肥能力，是药用植物生长所需的各种养分的重要来源［7，29］，但有研究表明高肥力不利于地下部品质改善和提高［30］，可能是有机质含量过高不利于仙茅有效成分积累的原因。海拔是药用植物生长环境中的重要生态因子之一，不同的海拔具有不同的温度、光照、土壤条件和空气等其他生态因子，高海拔利于功效成分的合成与积累［31］，本研究结果显示海拔与仙茅有效成分呈正相关，说明适宜的生长环境能促进仙茅的生长，从而形成优质的药材。总多酚与土壤因子相关性不显著，其原因需要进一步研究。

综上所述，仙茅不同有效成分含量受土壤影响程度不同，其主要影响因素也不同，是多个因素综合影响的结果。因此，在生产实践中应重视生态因子和土壤环境对仙茅药材质量的影响，种植过程中可通过适当控制有机质、全磷和交换性钙的含量，合理增施钾肥等措施促进仙茅有效成分的形成和含量的积累。