青岛胶州大白菜根腐病病原菌鉴定及其生物防治

宋雨萌，刘文杰，宗茂，罗兰

(青岛农业大学植物医学学院/山东省植物病虫害绿色防控工程研究中心，山东青岛 266109)

大白菜起源于中国，是我国第二大蔬菜，在均衡市场供应、稳定蔬菜价格等方面具有重要作用[1]。 大白菜因其含有多种维生素、矿物质及纤维素而具有保健作用[2]。 胶州大白菜为我国地理标志农产品，青岛常年种植面积约为全市蔬菜总面积的16%，因其具有独特品质而深受人们喜爱[3-4]。 但随着大白菜种植面积增大和复种指数提高，生产中常常受到多种有害生物的危害，如霜霉病[5]、黑斑病[6-7]及根肿病[8-9]等，对大白菜生产造成严重的经济损失。

大白菜根腐病是由多种病原菌侵染引起的土传真菌病害，对白菜产量造成很大影响。 常见的病原菌有瓜果腐霉菌(Pythium aphanidermatum)[10]、芸薹腐霉(Pythium brassicum)[11]和多种镰刀菌(Fusariumspp.)[12]。 明确病原菌种类对其防治具有十分重要的意义。 本试验对山东青岛胶州大白菜主要产区的根腐病病原菌进行分离、鉴定，研究生物药剂对其防治效果，为其绿色防治提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试病样:大白菜根腐病病样于2019 年10月在青岛胶州西安家沟村大白菜研究所基地采集，带回实验室进行病原分离。

供试培养基:马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基(马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂粉15 ～20 g，蒸馏水1 000 mL)。

供试试剂:DNA 提取试剂盒、DNA Marker(100～2 000 bp)、引物ITS1 和ITS4、引物TEF1 和TEF2、TaqDNA 聚合酶、dNTP 等均为上海生工生物工程(上海)股份有限公司产品。

供试大白菜品种为“胶白一号”，种子由青岛胶州大白菜研究所提供。

供试药剂:3 亿CFU/g 哈茨木霉菌可湿性粉剂、100 亿CFU/g 枯草芽孢杆菌可湿性粉剂均为美国拜沃股份有限公司产品。

1.2 试验方法

1.2.1 大白菜根腐病病原菌的分离与纯化 采用组织分离法对大白菜根腐病病菌进行分离[13]。取发病的大白菜根部病块，用75%乙醇处理30 s、无菌水冲洗3 次后吸干水分置于PDA 平板上，再放入28 ℃恒温培养箱中，待出现菌落后进行纯化，4 ℃保存备用。 对大白菜根腐病样本进行多次病原菌分离共获得两种分离物，分别编号为BCGF1 和BCGF2。

1.2.2 大白菜根腐病病原菌的形态学观察 将分离到的菌株接种到PDA 培养基上，置于28 ℃下培养7 d，观察菌落特征。 挑取适量病原菌菌丝制片镜检，观察其分生孢子形态，参照文献[14-15]中的方法对分离到的病原菌进行形态鉴定。

1.2.3 大白菜根腐病病原菌的分子生物学鉴定

利用上海生工生物工程(上海)股份有限公司DNA 快速抽提试剂盒对分离的病原菌进行基因组DNA 提取，并以此为模板进行PCR 扩增。 引物为ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′和ITS4(5′ -TCCTCCGCTTATTGATATGC - 3′)[16]、TEF1(5′-ATGGGTAAGGARGACAAGAC-3′)和TEF2(5′-GGARGTACCAGTSATCATGTT-3′[17]。PCR 产物由上海生工生物工程(上海)有限公司测序。 将获得的序列进行BLASTn 比对，根据比对结果选择同源性较高的序列及标准菌株，采用UPGMA 法运用MEGA 7.0 软件构建系统发育树，确定其分类地位。

1.2.4 大白菜根腐病病原菌的致病性测定 采用土壤接种法进行致病性测定[13]。 先将分离到的菌株配成1×107个/mL 的孢子液，按每株5 mL灌注到健康的大白菜幼苗根部，共接种5 株，以无菌水为对照，2 周后观察幼苗发病情况。 对发病幼苗进行组织分离，与接种的菌株比对鉴定。

1.2.5 大白菜根腐病的生物防治 采用盆栽法测定生防菌剂对大白菜根腐病的防治效果[18]。用麦粒培养基分别培养BCGF1 和BCGF2 菌株。待其产孢后，用无菌水配成孢子悬浮液。 采用灌根法按每杯接入10 mL 浓度105CFU/g 土孢子液(BCGF1 和BCGF2 各5 mL)培育1 d 后，将培育至2 片真叶的白菜幼苗移栽至接种致病菌的小杯中(1 株/杯)，用微生物杀菌剂哈茨木霉菌WP 200 倍液和枯草芽孢杆菌WP 500 倍液按每杯10 mL 灌根，同时设不接枯萎病菌和只接枯萎病菌为阴性对照和阳性对照。 每处理10 株，重复3 次。正常管理，20 d 后调查各处理白菜幼苗的株高、根长、鲜重及发病情况并计算病情指数和防治效果[19-20]。

病情指数(%)＝Σ(各级病株数×相对级数值)/(调查总株数×最高病级)×100 。

防治效果(%)＝(空白对照病情指数-处理病情指数)/空白对照病情指数×100 。

1.3 数据分析

试验数据采用SPSS 17.0 软件进行统计分析，用Duncan’s 新复极差法进行差异显著性检验。

2 结果与分析

2.1 大白菜根腐病的田间发病症状

大白菜根腐病苗期和成株期均可发病。 发病初期，生长缓慢，叶片褪绿，后期整株萎蔫(图1A)，似缺水状。 病株与未发病株相比，须根少至无(图1B)。 剖开根部，维管束变褐(图1C)。

图1 大白菜根腐病症状

2.2 大白菜根腐病病原菌形态学鉴定

菌株BCGF1 和BCGF2 接种到PDA 平板28℃培养7 d 后，菌落直径均为45 mm。 BCGF1 菌落突起絮状，菌丝白色质密(图2A)；BCGF2 菌落浅粉略带紫色，菌丝较稀疏(图2B)。 镜检可观察到小型、大型分生孢子和厚垣孢子。 其中，大型分生孢子为弯月形或镰刀形，2 ～9 个隔膜，多数为3个隔膜，大小为(20.6 ～36.5) μm×(2.5 ～5.8)μm(n ＝20)，见图2C、D；小型分生孢子多为单细胞，形状有卵形、椭圆形、肾形等，大小为(4.3 ～10.2)μm×(2.4～4.5) μm(n ＝20)。 分生孢子着生于从菌丝伸出的产孢细胞上(图2E、F)。 厚垣孢子为圆形或卵圆形，壁光滑或有突起，绝大多数无色、少色，直径为3.5～9.8 μm。 根据病原菌的形态特征并结合相关文献[14-15]，初步鉴定菌株BCGF1和BCGF2 均为镰刀菌(Fusariumspp.)。

图2 大白菜根腐病病原菌菌落与分生孢子形态特征

2.3 大白菜根腐病病原菌分子生物学鉴定

经测序，菌株BCGF1 和BCGF2 的ITS 序列分别为547 bp 和548 bp。 根据NCBI 中BLASTn比对结果，菌株BCGF1 和BCGF2 的ITS 序列与尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum，登录号为KJ774041.1 和MF460362.1)的序列相似度均为100.00%。 经测序，菌株BCGF1 和BCGF2 的tef序列分别为656 bp 和676 bp。 菌株BCGF1 的tef序列与F. oxysporum(登录号为HE801565.1)的序列相似度为99.36%，菌株BCGF2 的tef序列与F.oxysporum(登录号为HE801565.1)的序列相似度为99.70%。 根据比对结果，下载与目标菌株相关的同源序列，利用Mega 7.0 软件构建系统发育树。 系统发育分析结果表明，菌株BCGF1 和BCGF2 的ITS 序列与尖孢镰刀菌(F. oxysporum)在同一分支上，具有较高同源性，相似度100%(图3A)。 菌株BCGF1 和BCGF2 的tef序列与尖孢镰刀菌F. oxysporum在同一分支上，具有较高同源性，相似度99.36%(图3B)。 结合形态学特征，确定菌株BCGF1 和BCGF2 属于尖孢镰刀菌(F. oxysporum)。

图3 菌株BCGF1 和BCGF2 的系统发育树

2.4 大白菜根腐病病原菌致病性测定

采用土壤接种法进行致病性测定。 大白菜栽培方式为草炭蛭石基质盆栽。 接种5 mL 浓度1×107个/mL 的孢子菌悬液，以灌入等量无菌水为对照。 接种7 d 后开始发病，BCGF1 和BCGF2 均使大白菜幼苗发病。 与未接菌植株相比较，初期表现为叶片萎蔫发黄，生长缓慢，严重的枯萎死亡(图4A、B)。 拔出还未死亡的病苗发现根部受害明显，根部发黑，须根很少(图4C)。 未接菌植株根部，须根多且未变色(图4D)。 发病症状与田间大白菜萎蔫病发病症状一致。 从发病部位重新分离病原菌，得到的分离物与接种菌株形态学和基因序列相同，符合柯赫氏法则，证明所接菌株为大白菜根腐病的致病菌。

图4 土壤接种法测定苗期根腐病菌致病性

2.5 大白菜根腐病的生物防治

盆栽试验结果表明，生防菌剂对大白菜根腐病均有一定的防治效果。 哈茨木霉菌和枯草芽孢杆菌WP 灌根处理20 d 后，病情指数分别为32.56%和33.82%，均显著低于病原菌接菌对照处理的96.67%，清水对照未发病。 哈茨木霉菌WP和枯草芽孢杆菌WP 的防治效果分别为66.32%和65.02%(表1)。 由此表明，上述两种生防菌剂对大白菜根腐病具有较好的防治效果。 另外，经生防菌剂处理的大白菜幼苗鲜重、株高和根长与接种根腐病菌大白菜的幼苗差异显著，尤其是枯草芽孢杆菌WP 对大白菜生长有一定的促生作用，其鲜重与未接菌幼苗和哈茨木霉菌WP 处理差异显著。

表1 生防菌剂对盆栽大白菜根腐病的防治效果

3 讨论与结论

本试验对分离自大白菜根腐病植株的病原菌进行显微形态学观察、分子生物学鉴定、接种验证和致病性测定，明确青岛胶州大白菜根腐病由尖孢镰孢菌(F. oxysporum)侵染引起。 这一结论与闫文雪等报道的结果相符，而与山东济南及青岛白菜萎蔫病和根腐病是由瓜果腐霉菌(P. aphanidermatum)和芸薹腐霉(P. brassicum)侵染引起的结论不同[10-11]。 本试验结果对于该病害的防控具有十分重要的指导意义。

镰刀菌是一种能够危害多种作物的病原真菌。 研究发现，镰刀菌可侵染多种作物导致其发生枯萎死亡[21]。 枯萎病是大白菜生产中的一种重大病害，主要危害根部维管束组织，且产生真菌毒素造成整株枯萎死亡，严重影响产量和品质，严重制约着大白菜产业发展。 目前生产上对枯萎病主要还是采用化学防治，但由于化学杀菌剂使用所致作物抗药性及环境污染等问题，生物菌剂愈来愈受到人们的关注[22-23]，其以诸多优势而在病害防治中被广泛应用。

本试验结果表明，哈茨木霉和枯草芽孢杆菌WP 对大白菜枯萎病具有较好的防治效果，相对防效分别为66.32%和65.02%。 哈茨木霉和枯草芽孢杆菌WP 处理的大白菜幼苗鲜重、株高和根长与接菌对照相比显著增加，枯草芽孢杆菌WP对大白菜鲜重的促生作用更优。 该结论可为大白菜根腐病的绿色防控提供重要参考。